GC/MS法分析α，β－不飽和醛類香料的轉化產物

席 輝，任勝超，盧斌斌，柴國璧，曾世通，王丁眾，伍錦鳴，孫世豪*，王 華*，趙瑞峰，宗永立

1.中國煙草總公司鄭州煙草研究院，鄭州高新技術產業開發區楓楊街2號 450001 2.廣東中煙工業有限責任公司技術中心，廣州市荔灣區東沙環翠南路88號 510385

α，β-不飽和醛類香料是重要香原料中的一類，這類香料在食品添加劑名單GB 2760—2014中收錄60多種［1］，在煙草制品中也有廣泛應用［2-3］。這類香料因其α，β-不飽和結構而具有較強的活性，易受到環境條件的影響，該類化學改變時常會引起香料產品品質的改變以致引起安全風險的增加［4-7］。因此，了解這類香料在環境中的轉化產物，針對性建立有效檢測方法并實施有效監測，對于該類香料產品的品控具有重要意義。

通常情況下，一種化學物質在自然存放的條件下發生化學轉化的過程緩慢，開展相關研究通常要借助因素實驗。因素實驗是化學原料藥穩定性研究中的重要方法之一。開展因素實驗一個重要目的就是了解影響化合物發生轉化的環境因素及可能的轉化途徑與產物，為建立轉化產物的分析方法提供科學依據［8］。為了縮短轉化產物形成的過程，因素實驗通常在較為極端的條件（例如溫度大于60℃）下進行［9］。大量研究［10-14］顯示，溫度通常是影響一種化學產品在環境中發生化學轉化的重要因素。在存放條件下，香料的穩定性也主要受溫度、濕度、含氧量、光照等環境因素影響，其中溫度是最易于發生改變的環境因素之一。

理論上，單獨存放的α，β-不飽和醛類化合物發生化學變化主要源自于環境中氧氣引發的自身氧化反應，產物主要是α，β-不飽和酸［15］。對于有機酸的分析一般采用先提取后甲酯化，再借助GC/MS分析的方式。但在這種相對劇烈的衍生化條件下，樣品中的不飽和醛可能會對不飽和酸產生干擾，進而影響實驗結果。因此，需要尋找更為合適的不飽和酸分析方法。本研究中以常見的7種α，β-不飽和醛類香料為研究對象，借助氣相色譜-質譜（GC/MS）方法考察溫度因素實驗下α，β-不飽和醛類香料的轉化產物，并針對主要轉化產物建立定量分析方法，旨在為α，β-不飽和醛類香料產品的品質監控提供方法。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

實驗室室溫存放的11個香料樣品，分別由北京工商大學、河南中煙工業有限責任公司、上海應用技術大學提供，其中，北京工商大學提供了反式-2-戊烯醛、反式-2-己烯醛、反式-2-辛烯醛、反式-2-壬烯醛和反式-2-癸烯醛5個香料樣品；河南中煙工業有限責任公司提供了反式-2-己烯醛、反式-2-十一烯醛和肉桂醛3個香料樣品；上海應用技術大學也提供了反式-2-己烯醛、反式-2-十一烯醛和肉桂醛3個香料樣品。實驗室儲存樣品的初始純度和生產廠家與標準樣品一致。

反式-2-戊烯醛（97%，北京伊諾凱科技有限公司）；反式-2-己烯醛、反式-2-癸烯醛（98%，阿達瑪斯試劑有限公司）；反式-2-辛烯醛（95%）、肉桂醛（99%）（北京百靈威科技有限公司）；反式-2-壬烯醛、反式-2-十一烯醛［95%，西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司］；反式-2-戊烯酸（≥95.0%）、反式-2-癸烯酸（≥95.0%）、反式-2-辛烯酸（≥98.0%）、反式-2-壬烯酸（≥92.0%）、反式-3-己烯酸（≥95.0%，內標）（日本東京化成工業株式會社）；反式-2-己烯酸（≥98.0%，上海梯希愛化成工業公司）；反式-2-十一烯酸（≥95.0%，美國Sigma公司）；肉桂酸（≥99.0%）、二氯甲烷（色譜純）、乙醇（色譜純）（德國Merck公司）。上述標準樣品儲存條件為0～4℃避光冷藏。

Agilent 7890A/5975C型氣相色譜-質譜聯用儀（美國Agilent公司）；藥品穩定性試驗箱（上海蘇盈試驗儀器有限公司）；AB104-S電子天平［感量0.000 1 g，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司］；2 mL白色色譜瓶（美國Agilent公司）；10 mL容量瓶、Transferpette S移液器（德國Brand公司）。

1.2 方法

1.2.1 因素實驗

參照化學原料穩定性實驗中因素實驗的方法進行因素實驗，具體步驟：取7種α，β-不飽和醛類樣品各0.5 mg，分別置于2 mL無色透明色譜瓶中，置于相對濕度（RH）（60±5）%、溫度（80±2）℃的藥品穩定性試驗箱中，存放2（周）后取出，進行下一步分析。

1.2.2 樣品制備及分析

α，β-不飽和醛轉化產物定性分析樣品的制備：取經過因素實驗的樣品，直接向每個色譜瓶中移入1 mL二氯甲烷，振蕩溶解后，即為α，β-不飽和醛轉化產物定性分析樣品。

內標標準溶液：取反式-3-己烯酸，以乙醇為溶劑，配制成濃度為22.0μg/mL的溶液，即為內標標準溶液。

標準工作溶液：分別精確稱取一定量7種α，β-不飽和酸置于10 mL容量瓶中，以內標標準溶液為溶劑配制標準混合儲備溶液；在標準混合儲備溶液的基礎上，采用等比稀釋的方式配制一系列濃度的標準溶液，即為標準工作溶液。

實驗室儲存香料產品分析用樣品的制備：精確稱取實驗室儲存香料產品，以內標標準溶液為溶劑，配制成0.5 mg/mL溶液，采用GC/MS法進行樣品分析。分析條件：

色譜柱：DB-WAXETR毛細管柱（60 m×0.25 mm i.d.×0.25μm d.f.）；載氣：He，99.999%；流速：1.0 mL/min；進樣口溫度：250℃；進樣量：1μL；進樣模式：分流進樣，分流比10∶1；升溫程序：50℃電離方式：EI；電離能量：70 eV；離子源溫度：230℃；傳輸線溫度：280℃；溶劑延遲時間：10 min；掃描模式：定性分析采用全掃描模式，質量掃描范圍50～400 amu；定量分析采用SIM模式。各目標物的定量和定性離子如表1所示。

表1 GC/MS分析7種α，β-不飽和酸的SIM掃描參數Tab.1 SIM parameters of GC/MS for seven α，β-unsaturated acids

1.2.3 數據處理與分析

利用Microsoft Excel 2010軟件進行數據分析處理。

2 結果與討論

2.1 溫度對α，β-不飽和醛類香料的影響

通常情況下，化合物在環境中的穩定性除受自身結構因素影響外，還受存放環境因素影響，其中溫度是主要影響因素之一。以反式-2-己烯醛為例，其在不同溫度下存放時的質量百分比變化如圖1所示。可以看出，在不同溫度下，反式-2-己烯醛的量均會隨存放時間的增加逐漸減少；在相同存放時間內，溫度越高，其質量百分比下降幅度越大。實驗中發現，含有與反式-2-己烯醛類似的α，β-不飽和醛類香料均具有類似特征。這表明，α，β-不飽和醛類香料在環境存放過程中會發生化學轉化，而且，溫度對該類香料的穩定性有重要影響。

圖1 反式-2-己烯醛在不同溫度下存放時質量百分比變化Fig.1 Content change of trans-2-hexenal stored at different temperatures

2.2 α，β-不飽和醛類香料轉化產物的定性分析

為快速了解α，β-不飽和醛類香料轉化產物的種類組成，借鑒藥品穩定性實驗中的因素實驗方法，在極端條件（80℃）下將α，β-不飽和醛類香料存放2周。采用GC/MS法分析經過因素實驗得到的樣品，考察轉化產物的組成特征。以反式-2-己烯醛為例，樣品經過因素實驗的GC/MS總離子流色譜圖如圖2所示。借助Wiley標準質譜庫比對鑒定化合物，對α，β-不飽和酸類物質采用標準物質進一步確認，結果見表2。可以看出，進行因素實驗2周后，7種α，β-不飽和醛類香料均生成多種轉化產物，主要為酸類物質，其中以α，β-不飽和酸為主。

顯然，這些香料分子因本身結構存在差異，各種α，β-不飽和醛的具體轉化產物也存在明顯差異。但進一步比較7種α，β-不飽和醛類香料在因素實驗下的轉化產物可以發現，這些轉化產物有一個共同特點，即主要轉化產物均是與α，β-不飽和醛對應的α，β-不飽和酸，這與理論結果一致［16］。這說明在存放過程中，α，β-不飽和醛主要發生基于自由基鏈反應的自身氧化反應［17］。可見，α，β-不飽和酸有望成為α，β-不飽和醛類香料產品化學品質改變的標志物。同時，轉化產物中還含有少量的脂肪酸、脂肪醛等物質。原因可能是α，β-不飽和醛在存放過程中先經過逆Aldol反應生成飽和脂肪醛，這些飽和脂肪醛進一步氧化生成飽和脂肪酸［18］。

另取一組α，β-不飽和醛類香料樣品，在80℃下存放，每間隔1周取樣，以內標標準溶液溶解，進行GC/MS定量分析，連續測試7周，考察α，β-不飽和醛和相應酸質量百分比的變化，結果見圖3。可以看出，隨存放時間的增加，樣品中α，β-不飽和酸的量呈增加趨勢，而相應醛的量呈降低趨勢。這表明，α，β-不飽和醛和相應酸的化學轉化關系密切，可以指示α，β-不飽和醛類香料的化學轉化程度。

2.3 α，β-不飽和酸的GC/MS定量分析

綜上可知，α，β-不飽和酸是相應醛類香料在環境中化學轉化的主要產物，可以指示α，β-不飽和醛類香料化學轉化的程度，因此，針對性建立α，β-不飽和醛類香料中α，β-不飽和酸的檢測方法對于α，β-不飽和醛類香料的品質監控具有重要意義。在本研究中，結合定性分析結果，建立了分析7種α，β-不飽和酸的GC/MS方法。

圖2 香料樣品的總離子流色譜圖Fig.2 Total ion chromatograms of flavor samples

表2 因素實驗條件下α，β-不飽和醛的轉化產物Tab.2 Converted products ofα，β-unsaturated aldehyde under factor experiment conditions

圖3 在80℃條件下α，β-不飽和醛類香料存放過程中α，β-不飽和酸和醛量的變化Fig.3 Changes ofα，β-unsaturated acid and aldehyde contents inα，β-unsaturated aldehyde flavor stored at 80℃

在定性分析α，β-不飽和酸時，發現使用DBWAXETR色譜柱時，α，β-不飽和酸的色譜峰形較好。為盡可能避免衍生化反應過程，簡化分析方法，將獲取的樣品直接進行GC/MS分析。結果顯示，在優化的色譜條件下，7種待測α，β-不飽和酸類物質及內標化合物在30 min內即能流出，分析時間短，分離效果好。采用優化后的色譜條件考察了系列濃度的α，β-不飽和酸標準混合工作溶液，7種α，β-不飽和酸類物質的典型色譜圖如圖4所示。

以目標物峰面積與內標峰面積之比（y）對相應濃度（x，μg/mL）進行回歸，得到各目標物的標準工作曲線、線性范圍；對最低濃度的標準混合工作溶液重復分析10次，計算結果的標準偏差（SD），分別以3倍SD和10倍SD計算方法的檢出限（LODs）和定量限（LOQs）；采用本方法重復5次測試因素實驗樣品，以測試結果的相對標準偏差（RSD）表示方法的精密度。結果（表3）表明，本方法的線性、精密度和靈敏度良好，能夠滿足分析要求。

圖4 采用GC/MS-SIM法獲取的7種α，β-不飽和酸的色譜圖Fig.4 Chromatograms of sevenα，β-unsaturated acids by GC/MS-SIM

表3 7種α，β-不飽和酸的標準曲線、相關系數、線性范圍、檢出限和定量限Tab.3 Calibration equations，correlation coefficients，linear ranges，LODs and LOQs of sevenα，β-unsaturated acids

2.4 實驗室儲存α，β-不飽和醛類香料檢測結果

收集不同實驗室在常溫下存儲的α，β-不飽和醛類香料樣品，以內標標準溶液為溶劑，配制0.5 mg/mL乙醇溶液，采用本方法進行分析，結果見表4。可以看出，從各實驗室收集到的α，β-不飽和醛類香料樣品中均檢測出相應的α，β-不飽和酸類物質，各種α，β-不飽和酸的質量分數介于15.8～450.6 mg/g之間。這表明，常溫下，實驗室儲存的α，β-不飽和醛類香料產品均會發生一定程度的化學變化。

進一步比較來源于不同實驗室的反式-2-己烯醛、反式-2-十一烯醛、肉桂醛等香料中α，β-不飽和酸的質量分數可以看出，儲存時間與α，β-不飽和酸的質量分數密切相關，對于同一香料樣品而言，存放時間越長，α，β-不飽和酸的質量分數越高。這與因素實驗結果一致，也進一步提示，α，β-不飽和酸是對應醛類香料產品化學品質變化的指標性產物，可作為標志物用于α，β-不飽和醛類香料樣品化學品質的評價。

表4 實驗室儲存的11個α，β-不飽和醛類香料樣品中α，β-不飽和酸的質量分數Tab.4 Contents ofα，β-unsaturated acids in 11α，β-unsaturated aldehyde flavor samples stored in laboratories

3 結論

①α，β-不飽和酸類物質是α，β-不飽和醛類香料的主要轉化產物，α，β-不飽和酸或可作為α，β-不飽和醛類香料化學品質變化的標志物。②建立的不飽和烯酸類物質的GC/MS分析方法的靈敏度高（LODs＜0.12μg/mL）、精密度好（RSDs＜4.5%），適用于α，β-不飽和烯醛類香料樣品中α，β-不飽和酸的檢測。③對不同實驗室儲存的11個α，β-不飽和醛類香料樣品抽樣檢測結果顯示，溫度因素實驗樣品和實驗室存放樣品中α，β-不飽和酸類物質質量分數與存放時間均呈正相關關系。