基于蛋白相互作用網絡的帕金森病相關信號通路關鍵蛋白的篩選

馬素亞，杜相宜，時晶

北京中醫藥大學東直門醫院，北京100007

帕金森病（PD）是一種以黑質紋狀體多巴胺能神經元變性為特征的進行性神經退行性疾病，臨床表現以運動癥狀為核心，伴隨一系列非運動癥狀，晚期可出現認知和精神障礙。其病理改變主要是中腦黑質致密部多巴胺能神經元減少，導致黑質紋狀體多巴胺含量降低。大腦中的多種信號轉導途徑與PD的發生密切相關［1］。本研究通過總結PD相關信號通路研究文獻，構建PD信號通路蛋白相互作用網絡，并使用cytoscape拓撲分析篩選PD信號通路蛋白相互作用網絡關鍵蛋白，從細胞分子水平為PD的治療提供理論支持和研究方向。

1 資料與方法

1.1 PD相關信號通路的篩選 通過計算機檢索中國知網、維普、PubMed數據庫，篩選PD信號通路相關研究，研究類型不限，檢索時間自各個數據庫建庫至2021年3月。檢索中文關鍵詞為“帕金森”和“信號通路”，英文關鍵詞為“Parkinson's disease”和“sig?naling pathway”。文獻納入標準：研究類型為臨床實驗或動物實驗或細胞實驗；研究疾病是PD；研究內容為信號通路。排除綜述、評論性文章、會議論文。信號通路納入標準：經篩選后研究文獻篇數≥5篇。

1.2 PD相關信號通路信息圖的獲取 在對PD信號通路文獻檢索后，使用BioCarta Pathway、CST、PathBank信號通路數據庫及文獻，下載完整信號通路信息圖。

1.3 PD信號通路蛋白相互作用網絡的構建與關鍵蛋白的篩選 在信號通路文獻及完整信號通路圖的基礎上，篩選各信號通路主要蛋白，蛋白簡寫使用Uniprot數據庫矯正。將篩選出的信號通路關鍵蛋白導入STRING數據庫，使用“Multiple proteins”選項，種屬限制為“Homo sapiens”。在得出結果后，導出.tsv格式文件至cytoscape軟件，構建信號通路蛋白相互作用網絡圖。使用拓撲分析，得出信號通路蛋白相互作用網絡關鍵蛋白。

2 結果

2.1 PD信號通路篩選結果 文獻檢索結果中，PubMed 730篇，中國知網361篇，維普85篇，共1 176篇。查重刪除55篇，閱讀題目及摘要后刪除841篇，共篩選出280篇文獻，涉及12條PD相關信號通路。選取通路文獻數≥5的研究，納入信號通路包括PI3K/AKT/mTOR信號通路、JNK信號通路、p38 MAPK信號通路、Wnt/β-catenin信號通路、Notch信號通路、SDF-1/CXCR4信號通路、NF-κB信號通路、JAK/STAT信號通路和Nrf2/ARE信號通路。見表1。

2.2 PD相關信號通路信息圖 見OSID碼。

2.3 PD相關信號通路蛋白相互作用網絡圖與關鍵蛋白的篩選結果 由STRING數據庫構建的PD相關信號通路蛋白相互作用網絡圖見OSID碼。經cytoscape拓撲分析得出蛋白相互作用網絡前10位關鍵蛋白分別為AKT1、MAPK1、Jun、p53、MAPK8（JNK）、c-MYC、TNF、PTEN、STAT3、mTOR，節點度分別為62、57、57、56、52、50、49、44、42、41。與PD相關的信號通路關鍵蛋白的篩選結果見表2。

3 討論

近年來PD在全球的發病率逐年上升，其增長速度已超過阿爾茨海默病，預計到2040年患者人數將達到1 420萬［15］。PD患者黑質多巴胺能神經元變性和丟失，腦內多巴胺生成減少，但黑質神經元細胞變性的機制仍不明確。分析PD相關信號通路有助于探討其發病機制，為PD的治療提供理論依據。本研究結果顯示，PI3K/AKT/mTOR信號通路是目前研究最多的信號通路，約占PD信號通路研究文獻的34%，JNK通路、p38 MAPK通路、Wnt/β-catenin通路、Notch信號通路、Nrf2/ARE通路和NF-κB通路研究也較多，均為PD信號通路的熱點通路。

表1 PD相關信號通路篩選結果

表2 PD相關信號通路關鍵蛋白篩選結果

PI3K/AKT/mTOR信號通路在中樞神經系統中廣泛存在，參與中樞神經系統細胞存活、自噬、突觸可塑性、神經發生、神經元增殖分化等生理過程。激活PI3K/AKT/mTOR通路可阻止細胞受到凋亡刺激，減少細胞凋亡［16］。

JNK信號通路是MAPK通路的重要組成部分，在細胞生長、凋亡和應激等過程中發揮重要作用。JNK作為應激激活蛋白激酶，可被炎癥細胞因子、熱休克以及紫外線照射等激活。激活的MAPK可作用于轉錄因子c-Jun、c-MYC、ATF2及抗調亡和促調亡蛋白等，發揮促細胞凋亡的作用［17］。

p38 MAPK信號通路是MAPK信號通路之一，與PD的發病密切相關。p38信號通路可促進細胞凋亡，與負性刺激相關，如應激、紫外線、滲透壓變化和細胞因子等均為其刺激因子。被激活的p38可激活多種下游信號分子，如TNF、c-MYC、p53、c-Jun、Caspase等，從而發揮促凋亡作用［18］。

Wnt/β-catenin信號通路是進化過程相對保守的通路，在正常胚胎發育以及成年組織穩態維持中發揮重要作用，參與細胞分化、發育、凋亡等過程，與神經退行性疾病如PD密切相關［19］。Wnt配體與細胞膜表面卷曲蛋白（Fz）受體及輔助性低密度脂蛋白受體相關蛋白結合，激活Fz受體；活化的Fz受體作用于散亂蛋白，使GSK-3β磷酸化失活，導致其介導的β-catenin降解過程受抑制，β-catenin水平升高。部分β-catenin進入細胞核，與T細胞因子/淋巴細胞增強因子結合，引起下游靶基因的轉錄，促進多巴胺能神經元細胞增殖轉化，維持多巴胺神經元的完整性［20］。

Notch信號通路具有高度保守性，在神經退行性疾病如PD中有重要作用，參與多種細胞生命活動，如細胞增殖、分化、凋亡等［21］。Notch受體與鄰近細胞上的配體結合，激活信號通路，隨后Notch蛋白發生水解，其胞內結構域NICD釋放入細胞質，并轉移到胞核，與胞核上的DNA結合蛋白CSL家族結合，形成轉錄因子，刺激靶基因轉錄，繼而調節其下游的靶點基因，參與神經系統疾病的發生［10］。

SDF-1在神經系統發育以及腦損傷中具有重要的調節和趨化作用，SDF-1大量地、選擇性地在發育的中樞神經系統中表達。CXCR4對維持中樞神經系統正常發育發揮重要作用，能促使神經元順其梯度改變發生遷移［22］。SDF-1特異性地與CXCR4受體結合，通過CXCR4促進二聚體形成、空間構象改變、內化以及激活與其相偶聯的G蛋白等機制，激活多種信號轉導通路［23］。

NF-κB信號通路在神經系統免疫應答過程中起核心作用，是免疫反應的主要轉錄因子。異常的炎癥反應是導致PD患者多巴胺能神經元丟失的主要因素之一，過度激活的NF-κB信號與PD的發病有關。在大多數細胞中，NF-κB與抑制性IκB蛋白偶聯，以不活躍的狀態存在于細胞質中；當信號通路被激活后，IκBα磷酸化和降解，釋放NF-κB二聚體（p65∶p50）轉位到細胞核，調節靶基因表達［24］。

JAK/STAT通路是一條特異性的細胞膜受體從激活到核基因表達的蛋白信號轉導級聯通路，可被多種細胞因子、生長因子以及激素所激活，廣泛參與細胞的增殖、分化成熟、凋亡及免疫調節等過程［25］。JAK/STAT信號通路的異常激活會導致多種自身免疫性和神經炎癥性疾病發生，如過表達α-SYN可導致PD［26］。JAK/STAT能夠直接調節跨膜受體與細胞核的聯系，STAT可被JAK磷酸化、二聚化，然后通過核膜轉運進入細胞核，通過與特定的DNA元件結合來調控細胞因子應答基因的表達［13］。

Nrf2/ARE信號通路激活是PD的重要神經保護調節因子［27］。Nrf2是神經元生長的細胞內調節因子，Nrf2激活后，從細胞質轉移到細胞核，啟動抗氧化蛋白酶的表達?？寡趸鞍酌钢饕ㄑt素加氧酶1（HO-1）和NADPH醌氧化還原酶1（NQO1），HO-1和NQO1高表達可延緩神經退行性疾病的發展［28］。Nrf2可激活多種抗氧化反應元件（ARE）驅動的抗氧化基因，在體外和體內阻止氧化應激，是神經治療學的多功能通路［29］。

本研究采用STRING數據庫構建PD相關信號通路蛋白相互作用網絡圖，經cytoscape拓撲分析得出蛋白相互作用網絡前10位關鍵蛋白分別為AKT1、MAPK1、Jun、p53、MAPK8（JNK）、c-MYC、TNF、PTEN、STAT3、mTOR。AKT又稱蛋白激酶B，相對分子質量為57×103，大約由480個氨基酸殘基構成，分為AKT1、AKT2、AKT3三種亞型。本研究結果顯示，AKT1是PD蛋白相互作用網絡最重要的蛋白。研究顯示，AKT1活性減低與PD的發病密切相關，AKT1通過調控轉錄發揮作用［30］。細胞凋亡是多巴胺神經元損傷的重要原因，MAPK是神經元凋亡的強效因子，其過度激活可導致PD神經元死亡［31］。本研究結果顯示，MAPK1、MAPK8均與PD的發生密切相關，MAPK1參與多種細胞過程，如細胞周期、細胞凋亡、細胞存活等，在PD病程進展過程中發揮一定作用［32］。MAPK8參與神經系統生理活動的主要是c-Jun N末端激酶。活化的MAPK8在淀粉樣斑塊形成、神經炎癥、突觸功能障礙中起重要作用，是神經退行性疾病的重要信號因子［33］。炎癥因子TNF-α與其受體相結合可觸發并啟動Caspase家族介導的細胞凋亡，進一步加重PD的病理進展。c-Jun作為一種轉錄因子，可以調控其他基因的表達，在受到外界刺激激活后，可快速表達合成Jun蛋白，而Jun蛋白是腦內神經細胞活化的標志［34］。p53是一種細胞應激傳感器，當p38MAPK通路激活后，可磷酸化p53，并使其核轉運進而發揮作用［35］。ODUMPATTA等［36］研究發現，MYC作為主要的轉錄因子在PD發病過程中發揮重要作用。PTEN在神經系統中表達，作為一種脂磷酸酶可導致PIP3去磷酸化變成PIP2，抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路，導致神經細胞死亡。PTEN可以調節神經干細胞增殖及神經元分化及凋亡，與神經系統疾病的發生發展及預后密切相關［37］。研究顯示，STAT3磷酸化后可促進細胞增殖，抑制細胞凋亡，同時能促進血管生成，為新生神經元和突觸提供營養作用［38］。mTOR是PI3K相關激酶家族成員，在自噬誘導中發揮具有重要作用，活化后的mTOR激酶可抑制自噬，抑制mTOR激酶活性能夠激活自噬進程［39］。

綜上所述，本研究對PD相關信號通路進行總結，利用生物信息學方法研究PD相關信號通路蛋白網絡中關鍵信號蛋白，找出前10位關鍵信號蛋白為AKT1、MAPK1、Jun、p53、c-MYC、JNK、TNF、PTEN、STAT3和mTOR，從PD的細胞分子水平方面為PD的進一步研究提供了理論支持。