動物類中藥抗癌機制研究?

吳 越，李賢煜，楊洪軍

(1. 南京中醫藥大學藥學院，南京 210000； 2. 中國中醫科學院醫學實驗中心，中醫藥防治重大疾病北京市重點實驗室，北京 100700； 3. 中國中醫科學院中藥研究所，北京 100700)

動物類中藥的應用在我國有著悠久的歷史，戰國時期《山海經》[1]便有關于麝、鹿、犀、熊、牛等藥用動物的記載。《本草綱目》共收載藥物1892種，其中動物藥461種[2]。清·唐容川在《本草問答》中論述“動物之功利，優甚于植物，以其動物之本性能行，而且具有攻性”[3]，指出了動物藥的優越性。

據報道，中藥材中抗癌作用確切的動物藥有蜈蚣、全蝎、蠶蛹、蛇毒、蟾酥、土鱉蟲、蛤殼、水蛭、牡蠣、蛤蚧、斑蝥、地龍等。對其進行梳理，有助于拓寬對動物藥研究的新思路和新策略。本文將從動物類中藥起效成分、抑癌機制方面進行闡述，并對其進行展望。

1 起效成分

動物類中藥的成分主要包括蛋白質(酶)類、多肽類、生物堿類、黃酮類和甾體化合物類[4-5]，且多數為復雜混合物。從動物體內分離抗癌特異的活性物質是研究動物藥的策略之一[6]。由于蛋白質、多肽等生物大分子結構復雜、分離獲取較困難，于是科學家們將注意力轉向了動物藥小分子活性物質的分離與篩選。目前，僅有小部分動物藥專屬成分被確切分離到，如蝎毒[10]、蠶蛹多糖、華蟾素等[24](見表1)。

1.1 蛋白質及多肽組分

目前對于動物藥中活性蛋白質和肽段的研究已經成為一個新的研究熱點，如文蛤多肽、蜈蚣抗腫瘤蛋白等均有強烈的抗腫瘤活性，廣泛應用于臨床[39]。

表1 起效成分歸納和分類比較

蛤殼有清熱利濕、化痰散結的功效，對肝癌、肺癌、胃癌、甲狀腺腫瘤等有明顯的抑制作用[16]。Wang等[15]通過研究文蛤中純化的抗腫瘤多肽即文蛤多肽(Mere15)，發現其能抑制A549細胞生長，抑制率呈劑量和時間依賴性，且主要通過促凋亡與抗轉移途徑來抑制腫瘤生長，具有開發為治療人肺癌多靶點治療劑的潛力。

蜈蚣具有鎮痛、中樞抑制、調節免疫、抗腫瘤等作用。Zhou等[12]發現，蜈蚣的醚提物和醇提物均可在小鼠體內抑制宮頸腫瘤的生長。Ma等[14]通過研究蜈蚣的乙醇提取物發現，其可誘導腫瘤細胞凋亡，可作為人類癌癥潛在的治療藥物之一。張麗等[11]從蜈蚣中分離純化得到較純的蜈蚣抗腫瘤蛋白(CGⅠ)，對人宮頸癌細胞Hela和人胃癌細胞BGC-823有很強的體外抑制作用。

Zhan等[37]通過研究中華土鱉蟲乙醇提取物(alcohol extracts of the centipede scolopendra subspinipes mutilans,AECS)發現，其可通過調節MAPK信號通路和相關轉移因子發揮抗乳腺癌細胞增殖侵襲作用，可成為干預乳腺癌的潛在藥物。Dai等[38]研究了土鱉蟲提取物對肺癌細胞系A549細胞增殖的抑制作用,發現土鱉蟲70%乙醇提取物有效，且可通過抑制血管生成從而抑制癌細胞生長。此外，王鳳霞等[36]從土鱉蟲新鮮雌蟲體中分離純化得到分子量約為72kDa的抗腫瘤活性蛋白成分，并命名為ESP72，發現其對人A549肺癌細胞也有抑制作用。

全蝎中含有蝎毒、核苷等活性成分，具有抗腫瘤功效。Emanuelly等[8]研究了蝎毒對宮頸癌細胞系的影響，發現其對HeLa細胞有細胞毒性作用。Wang等[40]發現，蝎毒多肽提取物可誘導體外培養的良性膠質瘤U251-MG細胞凋亡。

水蛭是破血逐瘀之良藥。Lu等[29]發現，重組水蛭素能劑量依賴性地抑制HepG2喉癌細胞的黏附、遷移和侵襲且呈劑量依賴性。Guo等[31]發現，水蛭素能顯著抑制凝血酶的活性，并抑制腫瘤的生長與轉移。李先建等[27]發現，水蛭素能抑制肝癌HepG2細胞株的增殖、凋亡、遷移及侵襲。牟忠祥等[41]發現，水蛭素活性因子對S180腫瘤和雞胚絨毛尿囊(CAM)新生血管具有較強的抑制作用。

牡蠣，也是歷版中國藥典收載的中醫臨床常用藥。Zhong Ming等[18]研究了低分子量牡蠣多糖(low molecular weight oyster polysaccharide, LMW-OPS)，發現其能顯著抑制腫瘤生長。Sakaguchi Kaito等[19]發現，牡蠣30%～50%乙醇提取物(ethanol precipitate of oyster extract, EPOE50)可增強NK細胞活性，同時EPOE50可能通過NK細胞活化抑制小鼠腫瘤的生長。Wang等[20]研究利用芽孢桿菌蛋白酶生產的富含寡肽牡蠣水解物，發現牡蠣水解物對小鼠產生了很強的免疫刺激作用，這可能激發其抗腫瘤活性。

蛤蚧即大壁虎，多項研究表明壁虎具有良好的抗腫瘤功能。Huang等[33]檢測壁虎水提物對人肝癌細胞Huh7的影響發現，壁虎水提取物可抑制Huh7肝癌細胞生長并呈劑量與時間相關性。Kim等[34]通過研究壁虎中蛋白成分在人膀胱癌細胞5637中的抗腫瘤作用及其細胞機制，發現壁虎蛋白可誘導膀胱癌細胞凋亡，而對正常細胞沒有任何細胞毒性作用。

蠶蛹作為一種常用的動物類中藥，其應用有著悠久的歷史。Li等[22]發現，蠶蛹蛋白水解物(silkworm pupa protein hydrolysate，SPPH)能特異性地抑制人胃癌細胞Sgc-7901的增殖并呈劑量與時間依賴性。

綜上，蛋白質和多肽成分是動物類中藥的獨有組分，或許是其療效區別于植物類中藥的原因。但其在進行蛋白質純化的過程中，部分試劑與操作會促使蛋白質的空間結構丟失，進而失去生物活性，那么究竟是否這些蛋白質或多肽發揮抑癌作用，還是僅有部分特殊位點發揮功能，亦或是其他成分？值得進一步研究與思考。

1.2 小分子化合物組分

中藥中的小分子化合物組分主要包括甾體類、生物堿類、黃酮類、多糖類、砧烯類、脂肪族類、芳香族類。動物藥中小分子類化合物往往具有成分明確、藥效顯著、作用機制清晰等特點。

全蝎中的蝎毒中含有有機酸、酯類及少量游離氨基酸。迄今為止，已經從蝎毒中分離出數十種蝎毒素單體[7]。蝎毒可以特異性阻滯鉀離子通道, 其受體已被定位。氯離子通道在細胞膜信號傳導中具有重要作用, 而蝎毒中提取的氯毒素(Chlorotoxin)是氯離子通道的特異性阻斷劑[42]。

蠶蛹中的蠶蛹多糖具有多種藥理作用[21]。王什等[43]檢測蠶蛹中的多糖組分，發現隨著多糖提取物濃度增加，人肝癌細胞SMMC-7721的Bax、p53蛋白表達均逐漸升高，而細胞Bcl-2蛋白的表達逐漸降低，得出蠶蛹多糖提取物具有一定抗肝癌活性的結論。

華蟾素是中華大蟾蜍的有效提取物，臨床應用較為廣泛，已有研究表明華蟾素具有明確的抗腫瘤作用[23]。Cheng等[24]對華蟾素及其主要活性成分蟾蜍靈進行了體外、體內和臨床研究，發現其可以通過抗增殖、誘導凋亡、抗轉移、抗血管生成、上皮-間質轉化抑制、抗炎、Na+/K+-ATP酶活性靶向、類固醇受體共激活子家族抑制等多種途徑抑制腫瘤的侵襲與遷移。Xiong等[25]發現，華蟾素可誘導人SGC-7901腫瘤細胞的凋亡。Li等[26]也發現，華蟾素可以通過細胞凋亡等多種途徑發揮其抗腫瘤作用。

小分子類化合物有著其獨特的優勢，由于其清晰的化學結構可對其進行化學修飾與減毒增效，如去甲斑蝥素的合成大大降低了其毒性[47]。進一步尋找動物類中藥中的小分子化合物，有助于進一步闡明動物藥的抗腫瘤機制與作用靶點。

2 抑癌機制概述

動物類中藥的成分復雜，其抑癌機制往往是多層次多靶點的。如蜈蚣乙醚提取物既可以誘導腫瘤細胞凋亡，又可以抑制癌組織新血管的生成[44-45]。現將目前動物類中藥較為清晰的抑癌機制進行總結(表2)

2.1 誘導腫瘤細胞凋亡

細胞凋亡是一種細胞程序性死亡的形式，指機體有序有效地去除受損細胞，細胞凋亡在癌癥的發生發展中具有重要作用。目前臨床使用的大多數抗癌藥物主要利用完整的凋亡信號通路來觸發癌癥細胞凋亡。因此，總結動物類中藥組分對細胞凋亡的影響有廣泛的生理和病理意義[51]。

Huang[33]發現，壁虎水提物能通過阻止LRP6與Frizzled6復合物的形成而抑制Wnt信號通路，從而抑制肝癌細胞的增殖、腫瘤球的形成及腫瘤干細胞的比例。Kim等[34]發現，壁虎蛋白可通過抑制Akt途徑并激活內在Caspase途徑，導致膀胱癌細胞的凋亡。郭夢麗等[32]發現，壁虎粗多肽(gecko crude peptides, GCPs)可通過下調VEGF-C(血管內皮生長因子C)、CXCR4(趨化因子受體4)、p-ERK1/2(細胞外調節蛋白激酶)、p-p38MAPK(磷酸化P38絲裂原活化蛋白酶)及p-Akt的表達水平而抑制HepG2(赫曼肝癌細胞)細胞的增殖與遷移，并誘導其凋亡。

Zhou等[12]發現，蜈蚣提取物可在小鼠體內抑制宮頸腫瘤的生長,可能是通過Bax和Caspase-3介導的線粒體信號傳導途徑誘導腫瘤組織的凋亡。Ding等[13]發現，蜈蚣提取物可通過阻止細胞周期G0-G1期，激活Caspase 9/3，下調bcl-2/bax蛋白比率以誘導腫瘤細胞凋亡。Ma等[14]發現，蜈蚣提取物可通過降低Bcl-2表達水平，升高Bak、Bax和Bad表達水平誘導A375細胞凋亡。孫婧[52]等研究發現，蜈蚣提取物具有顯著抑制人肝癌HepG2細胞株增殖的作用且呈明顯的量效關系。

Oliveira等[8]通過流式細胞術發現，蝎毒可誘導HeLa細胞的凋亡。Kampo Sylvanus等[9]通過研究東亞鉗蝎抗腫瘤鎮痛肽(buthus martensii karsch antitumor-analgesic peptide，BMK AGAP)對乳腺癌細胞干與上皮間質轉化的影響，發現BMK AGAP通過NFκB(核因子κB)和Wnt/β-連環蛋白信號通路下調Ptx3的表達，抑制乳腺癌細胞的遷移和侵襲。Moradi等[10]發現，通過蝎毒治療后的結腸癌細胞中，Bax(BCL2相關的X蛋白質)、Casp3(胱天蛋白酶3)和Trp53(細胞腫瘤抗原p53)顯著過表達，腫瘤組織Bcl-2 mRNA水平下降，說明其對腸癌胞具有特異性抑制作用。賈莉等[46]采用東亞鉗蝎毒(buthus martensii karsch, BMK)作為干預手段,發現其對Raji細胞具有生長抑制作用與誘導凋亡作用。

Li等[22]發現，SPPH能特異性地抑制人胃癌細胞SGC-7901的增殖，并以劑量與時間依賴的方式引起其異常形態特征。流式細胞術顯示，SPPH能抑制S期細胞周期。此外，SPPH還能引起活性氧(ROS)的積累和線粒體膜電位的去極化，抑制Bcl-2表達，促進Bax表達，最終導致細胞凋亡。王什等[43]以蠶蛹中的多糖組分為研究對象，利用CCK-8法檢測蠶蛹多糖提取物對人肝癌細胞SMMC-7721生長的抑制情況。Western blot檢測細胞凋亡相關蛋白(Bax、Bcl-2和p53)的表達，結果表明蠶蛹多糖提取物對SMMC-7721細胞的增殖具有抑制作用且呈時間和濃度依賴性(P<0.01)。隨著多糖提取物濃度增大，細胞Bax、p53蛋白的表達逐漸升高，Bcl-2蛋白的表達逐漸降低。

Wang等[15]通過研究表明，從文蛤中提取出的新型抗腫瘤多肽(Mere15)，可以通過促凋亡和抗轉移途徑抑制腫瘤生長。范成成等[32]發現，文蛤多肽處理后的肝癌細胞HepG2和膽管癌細胞QBC939的外形變化明顯，并出現凋亡小體。通過檢測細胞周期，經處理的肝癌細胞出現明顯的凋亡峰，表明文蛤多肽可以誘導癌細胞凋亡。Wang等[16]發現，文蛤多肽作用后，腫瘤細胞G2/M期細胞比例逐漸升高，微管蛋白聚合受到抑制，表明文蛤多肽具有抑制腫瘤細胞增殖的作用，其作用機制與誘導細胞凋亡及細胞周期阻滯有關。

表2 動物類中藥抗腫瘤作用機制概述

Lu等[29]發現，重組水蛭素通過調控Bcl-2和促凋亡蛋白Bad的方式，顯著抑制HepG2細胞的生存力并誘導細胞凋亡。李先建等[27]將含不同濃度水蛭素的培養液作用于肝癌HepG2細胞，采用MTT法檢測水蛭素對肝癌HepG2細胞增殖的影響，流式細胞法檢測水蛭素對肝癌HepG2細胞凋亡的影響，發現HepG2細胞凋亡率、侵襲及遷移個數隨水蛭素濃度增加而增加并呈濃度依賴性(P<0.05)。VEGF蛋白的表達量隨水蛭素濃度增加而明顯下調(P<0.05)，得出水蛭素能誘導肝癌HepG2細胞凋亡的結論。

Chi等[47]以羧甲基殼聚糖(carboxymethyl chitosan, CMCS)和去甲斑蝥素(norcantharidin, NCTD)為原料，通過酰胺化反應制備了新型聚合物藥物(Novel polymer-drug conjugates, CNC)。CNC偶聯物對胃腺癌細胞SGC-7901的增殖具有顯著的抑制作用，并能抑制人臍靜脈內皮細胞的遷移和成管。此外檢測表明，與游離NCTD比較，聚合物更有效地觸發sgc-7901細胞凋亡。進一步，CNC在balb/c裸鼠試驗中對sgc-7901胃腫瘤的抑瘤率為59.57%，并顯著降低毒性，增強了其體內抗腫瘤效果。同時研究發現，CNC可以通過上調TNF-α和Bax的表達，下調VEGF、Bcl-2、MMP-2和MMP-9的表達，抑制腫瘤轉移，誘導腫瘤細胞的凋亡。Chen等[57]采用NCTD對鼻咽癌細胞系進行處理，顯示細胞系中的胱天蛋白酶-3、胱天蛋白酶-8、胱天蛋白酶-9活化，抗凋亡蛋白Bcl-XL表達明顯降低，促凋亡蛋白Bak表達增加，表明NCTD能明顯促進鼻咽癌細胞的凋亡。

Li等[26]通過使用微陣列數據和計算機分析探討華蟾素抗腫瘤機制，發現其很可能在MCF-7細胞中以類似咪康唑的方式發揮抗腫瘤作用。

何道偉等[48]分析了細蚯蚓提取物對Eca-109細胞生長抑制作用及機制，發現在細胞檢測中有凋亡細胞出現，且細胞被阻滯在G0-G1期，DNA合成受阻，使腫瘤細胞受抑制，腫瘤體積縮小。

Sakaguchi Kaito等[19]實驗結果表明，EPOE50增強NK細胞活性，抑制腫瘤的生長。李鵬等[10]通過研究牡蠣天然活性肽(bioactive peptides of oyster,BPO)對人胃腺癌BGC-823細胞凋亡的生物學效應，發現BPO-1對胃癌細胞具有顯著的誘導凋亡作用。

誘導癌細胞凋亡是很多動物類中藥所共有的抑癌機制。誘導癌細胞凋亡的途徑有很多，報道最多的有兩條：一是通過細胞膜上的死亡受體激活半胱氨酸蛋白酶誘導細胞凋亡；二是通過胞質內線粒體途徑釋放細胞凋亡因子(ICE, APaf-1, Bcl-2, Fas/APO-1)激活半胱氨酸蛋白酶誘導細胞凋亡。而動物類中藥究竟通過哪條途徑誘導細胞凋亡的還值得進一步探討。

2.2 抑制腫瘤新血管生成

血管內皮細胞生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)是腫瘤血管生成因子(tumor angiogenesis factor, TAF) 重要的調控因子之一。腫瘤血管是腫瘤治療的重要靶位。腫瘤細胞分泌高水平的促血管生成因子，有助于形成異常的血管網絡，通過恢復腫瘤灌注和氧合使血管正常化，可以限制腫瘤細胞的侵襲性，提高抗癌治療的效果[54-55]。

劉細平等[45]采用裸鼠Bel-7404人異位肝癌移植模型，以蜈蚣提取液灌胃31 d后，用免疫組化法對腫瘤組織標本進行血管內皮細胞生長因子VEGF和促血管生成素2(Angiopoietin 2, Ang-2)的檢測發現，對照組VEGF與Ang-2的染色細胞數、染色強度及OD值均較治療組多而強，差異均有統計學意義(P<0.01)，說明蜈蚣提取液能抑制裸鼠Bel-7404移植瘤的生長，且與抑制腫瘤血管生成有關。

Lu等[29]發現，重組水蛭素可以顯著下調黏附與血管生成相關蛋白Fak和VEGF的表達，抑制腫瘤新血管生成。牟忠祥等[41]將水蛭素活性因子含藥載體種植于雞胚絨毛尿囊膜(chick chorioallantoic membrane, CAM)中，觀察藥物抑制新生血管的生長情況，并用計算機分析系統對CAM進行掃描發現，用藥組血管分布稀疏、間距增大，含藥載體周圍血管減少；模型對照組則血管分布密集、間距縮小、呈放射狀排列，說明水蛭素可以抑制新血管的生成。

大量研究報道，蛇毒組分可抑制血管生成[49]。Denise等[50]研究了蛇毒對各種類型癌細胞的抗腫瘤作用。從泡桐蛇毒中分離的去整合素樣金屬蛋白酶(Bothropoidin)，對人乳腺癌細胞Mda-mb-231具有抗腫瘤和抗血管生成作用。

曹付春等[35]通過免疫組織化學法檢測地鱉纖溶活性蛋白(eupolyphaga sinensis walker fibrinolytic protein, EFP)對S180和H22荷瘤小鼠腫瘤組織的微血管密度(microvascular density, MVD)，細胞培養液中VEGF和堿性成纖維生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)的影響發現，EFP含藥血清對人臍靜脈內皮細胞、肺癌、乳腺癌細胞有顯著抑制作用。ELISA法檢測結果表明，EFP含藥血清對人臍靜脈內皮細胞、肺癌、乳腺癌細胞的VEGF和bFGF表達均有抑制作用。

VEGF能刺激腫瘤毛細血管的生長，為腫瘤增殖和播散提供條件，并已發現在多種腫瘤體系中過度表達[55]。目前很多動物類中藥研究表明，可通過抑制VEGF的表達來抑制腫瘤新血管的生成，可為未來的進一步研究提供啟示。

3 討論與展望

目前對于動物類中藥的抗腫瘤作用研究成果主要體現在以下幾點。一是確定了一些新的有效成分并對其進行修飾。如去甲斑蝥素(NCTD)是中藥斑蝥中發揮抗癌成分斑蝥素的衍生物，是由斑蝥素去除1、2位的2個甲基后人工合成，是具有世界領先地位的，能升高白細胞作用的新型抗腫瘤藥物[47]；二是找到了一些新的中藥抗腫瘤的通路和靶點；三是開辟了一些新的動物類中藥研究方法。如SPME-GC-MS分析法等，均為動物類中藥的研究提供了可行的方法。

但從現有的研究可以看出，動物類中藥抗腫瘤作用研究還存在缺陷，諸如有效成分并不明確。動物藥的成分復雜，種類繁多，目前的研究大多局限于動物藥的溶劑提取物或含藥血清體內體外實驗中表現出的作用，并沒有對其成分進行深入剖析；二是作用機制模糊。目前有大量研究報道，很多動物藥都是通過誘導細胞凋亡發揮其抑癌作用，但是誘導細胞凋亡是適用于很多疾病治療的普適性機制(如糖尿病[56]、腎臟病[57]、哮喘等[58])，并不是動物類中藥發揮其抑癌作用的特有機制。且想要闡明動物類中藥抑癌機制只從細胞凋亡層面論述顯然不夠。細胞凋亡作為一種細胞“表象”，其背后的作用機制和作用靶點需要進一步探討；三是中藥具有多靶點多層次的抗腫瘤作用，為后續的研究增加了難度；四是中藥中的動物藥雖然抗癌作用往往超出植物藥，但是其毒性會對人體造成損傷，如蜈蚣、蛇毒等會造成毒性反應，故減毒增效是動物類中藥的潛在研究方向；五是研究手段單一。目前對于動物類中藥的研究手段主要采用MTT技術、CCK-8技術、細胞流式實驗技術、Western Blot技術、劃痕愈合技術等，用以檢測動物類中藥對癌細胞侵襲、遷移作用的影響，但并沒有從生物整體水平和分子層面進行深度剖析，因此整合分析很有必要。

動物類中藥具有成分復雜性、物質不穩定性、作用環節多樣性等特點。近年來，運用組學策略從分子生物學水平研究疾病狀態下基因、蛋白質、代謝產物等變化，找出藥物的作用通路與作用靶點，在中醫藥的研究中已被廣泛使用。運用組學的方法對動物類中藥進行研究，運用整合分析策略，將可能為研究動物類中藥的抗腫瘤機制開辟新思路。此外，還應充分參考生物藥的研究手段，建立一套適用于動物類中藥的研究方法。首先，應確定動物類中藥的物質基礎，充分利用技術的進步，將低溫柱層析等先進分離手段應用在動物藥的提取分離中。其次，應把目光聚焦到動物類中藥中的肽類物質上。大量研究表明，某些特定的動物肽類物質是具有強烈生物活性的[59]，是動物類中藥的重點起效成分。因此構建基于動物藥肽庫的高通量藥物篩選模型，并確立一套健全的評價體系，將更加有助于動物類中藥的開發與應用，為臨床用藥奠定基礎。