銅綠假單胞菌群體感應代謝產物通過細胞表面脂質結構域溶解誘導宿主淋巴細胞死亡的機制

祝司霞（攀枝花學院醫學院病原生物與免疫學教研室，攀枝花 617000）

群體感應是原核生物基于化學物質的交流機制［1］。基本模式下，社區中其他成員的胞內受體可感應出部分個體釋放的自體誘導劑，從而導致集體等基因自體誘導劑合成和同步活動，對于與宿主共生、毒力和社區生物膜形成具有重要意義［2-3］。銅綠假單胞菌是急性醫院感染的最常見病原體之一，尤其影響免疫功能低下的個體或重癥監護病房患者［4］。銅綠假單胞菌引起的感染包括呼吸機相關性肺炎、燒傷創面和手術部位感染及尿路感染，與患者高死亡率（＞30%）密切相關［5］。銅綠假單胞菌還可引發囊性纖維化、慢性阻塞性肺疾病或支氣管擴張患者慢性呼吸道感染［6］。銅綠假單胞菌具有2個群體感應電路：lasR-lasI及RhlR-RhlI，前者采用N-（3-氧代十二烷基）高絲氨酸內酯（3OC12 HSL或3oc）作為自動誘導劑，后者采用C4（丁酰基）HSL4［7-8］。3oc是研究最多的群體感應自動誘導劑，在哺乳動物宿主中具有重要作用［9］。3oc及類酰基鏈長度類似物可與膜型和活細胞雙層膜相互作用［10］。高濃度3oc可破壞質膜偶極電位，影響受體配體結合［11］。但低濃度3oc（5μmol/L）可明顯調節T淋巴細胞、嗜中性粒細胞和巨噬細胞活性［12］。本文將探討銅綠假單胞菌群體感應代謝產物通過細胞表面脂質結構域溶解誘導宿主淋巴細胞凋亡的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物SPF級C57BL/6野生型小鼠購自重慶醫科大學動物中心，8～10周齡時，感染銅綠假單胞菌，并進行3oc治療。感染前3 d給予無菌水代替3oc治療，另一組持續給予3oc治療直到實驗結束。性別、年齡相匹配的常規定植小鼠作為未經3oc治療的對照組。所有實驗程序經動物保護和使用委員會批準，并根據《實驗動物護理和使用指南》進行實驗。

1.1.2 主要試劑與儀器 銅綠假單胞菌培養物上清（碧云天生物試劑公司）；V-FITC和PI（英國Ab?cam公司）；SYBR greenⅠMaster Mix試劑盒（賽默飛世爾）；山羊抗小鼠抗體（美國Invitrogen公司）；兔抗caspase-3、兔抗caspase-9抗體（D35G2，美國Bio Legend公司）；流式細胞儀（美國貝克曼庫爾特有限公司）；Real-Time PCR System（應用生物系統公司）。

1.2 方法

1.2.1 銅綠假單胞菌菌株處理MDR銅綠假單胞菌分離株由1例醫院內肺炎患者的呼吸道材料培養而成，感染前，將銅綠假單胞菌置于37℃有氧氣氛中的cetrimid瓊脂（Oxoid）上培養24 h。

1.2.2 AnnexinV/PI凋亡檢測法檢測細胞凋亡HSL刺激細胞或不作處理，6 h后收集細胞，室溫下采用膜聯蛋白V-FITC和PI染色15 min，流式細胞術檢測細胞凋亡情況。銅綠假單胞菌共培養試驗中，分離C57BL/6小鼠骨髓淋巴細胞，并與WT型、lasI缺陷型或lasR缺陷型銅綠假單胞菌培養上清共同孵育6 h，顯微鏡下進行淋巴細胞計數。

1.2.3 免疫共沉淀和Western blot檢測蛋白表達免疫沉淀4μg山羊抗小鼠抗體與100μl蛋白A/G瓊脂糖室溫孵育2 h，HSL處理脾細胞（3×106個/ml）或不進行治療，收集細胞，免疫沉淀裂解緩沖液（50 mmol/L HEPES，pH=7.0，150 mmol/L NaCl，1%NP-，1 mmol/L EDTA，1 mmol/L苯基甲基磺酰氟，1 mmol/L NaF，1 mmol/L NaVO3和蛋白酶抑制劑混合物）裂解，4℃下加入抗體-珠子混合物反應3 h，低速離心（1 000 g，5 min）收集珠子，免疫沉淀裂解緩沖液（添加300 mmol/L NaCl）洗滌4次，最后1次洗滌后將沉淀物采用70μl 2×SDS上樣緩沖液懸浮并煮沸5 min，兔抗caspase-3和兔抗caspase-9抗體（D35G2）檢測caspase-3和caspase-9表達。HSL處理THP-1細胞（3×106個/ml）或不做處理。交聯測定：HSL刺激或不處理從C57BL/6小鼠脾臟或人THP-1細胞分離的CD4+T細胞，收集細胞，室溫下采用10 mmol/L DTSSP交聯30 min，1 mol/L Tris-HCl（pH=7.5）淬滅15 min，采用來自Bytotime Bio?technology的RIPA緩沖液（50 mmol/L Tris，pH=7.4，150 mmol/L NaCl，1%Triton X-100，1%脫氧膽酸鈉，0.1%SDS，1 mmol/L EDTA，1 mmol/L苯甲基磺酰氟，1 mmol/L NaF，1 mmol/L NaVO3和蛋白酶抑制劑混合物）與非還原SDS上樣緩沖液混合，如前所述分離脂筏。將THP-1細胞在MN緩沖液［25 mmol/L 2-（Nmorpholino）乙磺酸 和150 mmol/L NaCl，pH=6.5］中的1 ml 1%Triton X-100于冰上溶解20 min。將細胞裂解液用松散的dounce勻漿器勻漿10次，4℃下500 g離心7 min。上清7 000 g離心12 min，4℃下100 000 g離心50 min，記為DIG分數。所有樣品與3×SDS上樣緩沖液混合并煮沸5 min后進行Western blot分析。

1.2.4 RT-qPCR檢測mRNA表達 采用RVana miRNA分離試劑盒提取總RNA，TRIzol試劑分離RNA，采用Script逆轉錄試劑盒進行RT反應，反應條件：42℃60 min，85℃5 min。SYBR greenⅠMaster Mix試劑盒采用7300 Real-Time PCR System進行實時PCR反應，反應條件：95℃變性3 min，45個PCR周期（95℃15 s，60℃20 s），2-ΔΔCt法計算IL-1和IL-6相對表達，β-actin為內參，引物序列見表1。

表1 RT-PCR引物序列Tab.1 RT-PCR primer sequences

1.3 統計學分析 采用SPSS17.0軟件和Graph Pad Prism軟件進行統計學分析，實驗至少重復3次，數據以±s表示，多組間檢驗采用t檢驗或單因素方差分析，χ檢驗或Fisher精確檢驗計算Ftx表達和臨床病理學變量，Kaplan-Meier法建立生存曲線，并采用對數秩檢驗進行比較，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 3oc劑量依賴性降低細胞活性AnnexinV/PI凋亡檢測法檢測T細胞凋亡結果顯示，10、20和50μmol/L 3oc可促進T細胞凋亡，且呈劑量依賴性（P＜0.05，圖1、表2）。

圖1 AnnexinV/PI法檢測細胞凋亡情況Fig.1 Annexin V/PI detected cell apoptosis

表2 3oc對T細胞活化的影響（±s，%）Tab.2 Effect of 3oc on T cell activation（±s，%）

表2 3oc對T細胞活化的影響（±s，%）Tab.2 Effect of 3oc on T cell activation（±s，%）

Groups Control 10μmol/L 3oc 20μmol/L 3oc 50μmol/L 3oc F P Living cell 82.37±0.15 55.18±0.26 31.15±2.78 15.87±0.13 13.986 0.012

2.2 凋亡相關蛋白活性檢測 與對照組相比，3oc處理的CD4 T細胞中caspase-3和caspase-9蛋白活性降低，Cld caspase-3和Cld caspase-9蛋白活性增強（P＜0.05），3oc濃度與caspase-3和caspase-9表達呈負相關，與Cld caspase-3和Cld caspase-9表達呈正相關（P＜0.05，圖2、表3）。

圖2 Western blot檢測凋亡相關蛋白表達Fig.2 Expressions of apoptosis related proteins by Western blot

表3 凋亡相關蛋白表達（±s）Tab.3 Expressions of apoptosis related proteins（±s）

表3 凋亡相關蛋白表達（±s）Tab.3 Expressions of apoptosis related proteins（±s）

Groups Control 10μmol/L 3oc 20μmol/L 3oc 50μmol/L 3oc F P caspase-3 1.13±0.12 0.78±0.13 0.47±0.06 0.15±0.03 12.342 0.013 caspase-9 3.37±0.31 2.58±0.15 1.74±0.13 1.05±0.12 25.187 0.017 Cld caspase-3 0.28±0.06 0.54±0.13 1.27±0.18 2.15±0.19 13.946 0.018 Cld caspase-9 0.05±0.01 0.27±0.11 0.68±0.19 1.39±0.16 14.128 0.012

2.3 RT-qPCR檢測炎癥因子IL-1和IL-6 mRNA表達 與對照組相比，3oc處理的IL-1和IL-6 mRNA表達增加，且呈劑量依賴性（P＜0.05，表4）。

表4 IL-1和IL-6 mRNA表達（±s）Tab.4 Expressions of IL-1 and IL-6 mRNA（±s）

表4 IL-1和IL-6 mRNA表達（±s）Tab.4 Expressions of IL-1 and IL-6 mRNA（±s）

Groups Control 10μmol/L 3oc 20μmol/L 3oc 50μmol/L 3oc F P IL-1 1.14±0.13 2.75±0.16 3.27±0.28 3.87±0.32 13.635 0.013 IL-6 0.47±0.13 1.26±0.23 1.89±0.16 2.27±0.32 12.873 0.012

2.4 有序脂質結構域中的3oc為驗證HSL是否保留于質膜中，課題組將H9細胞（避免凋亡細胞的干擾）與500μmol/L 3oc HSL或3-oxo-C8HSL或3-oxo-C10 HSL孵育5/10 min，分級，并按不同方式提取和分離3oc HSL或3-oxo-C8或3-oxo-C10 HSL（上清、細胞溶質和膜），發現質膜級分中，膜和上清中3oc和3-oxo-C10含量更高，細胞溶質中3-oxo-C8 HSL含量更高（P＜0.05，表5）。

表5 有序脂質結構域中的3oc（±s，n=6）Tab.5 3oc in ordered lipid domain（±s，n=6）

表5 有序脂質結構域中的3oc（±s，n=6）Tab.5 3oc in ordered lipid domain（±s，n=6）

Groups Supernatant Cytosol Cell membrane F P 3oc 48.62±3.91 5.25±0.14 46.13±3.26 12.287 0.016 3-oxo-C8 HSL 38.75±3.18 40.12±2.87 21.13±2.26 13.254 0.027 3-oxo-C10 HSL 36.21±2.56 12.33±1.72 51.46±3.82 11.175 0.018

2.5 銅綠假單胞菌通過3oc誘導感染宿主細胞的淋巴細胞凋亡 為驗證HSL毒力是否可通過自動誘導劑介導的免疫抑制降低宿主防御能力，課題組采用WT（PAO1）、lasI缺陷型（ΔlasI）和lasR缺陷型（ΔlasR）銅綠假單胞菌培養物上清培養C57BL/6小鼠淋巴細胞，結果顯示ΔlasI和ΔlasR均可導致淋巴細胞數減少（P＜0.05），可能通過3oc發揮作用（圖3、表6）。為進一步證實結果，課題組 在C57BL/6小鼠氣管內接種PAO1、ΔlasI和ΔlasR突變體，突變體感染小鼠的肺部提取物顯示，銅綠假單胞菌菌落形成單位減少（P＜0.05，表7）。

圖3 細胞HE染色Fig.3 Cell HE staining

表6 細胞lasI缺陷和lasR缺陷對細胞數的影響（±s，%）Tab.6 Effect of lasi and lasR defections on cells number（±s，%）

表6 細胞lasI缺陷和lasR缺陷對細胞數的影響（±s，%）Tab.6 Effect of lasi and lasR defections on cells number（±s，%）

Groups PAO1 ΔlasI ΔlasR F P Number of cells 8.56±0.13 25.33±2.18 27.26±2.47 9.456 0.011

表7 3oc對T細胞活化的影響（±s）Tab.7 Effect of 3oc on T cell activation（±s）

表7 3oc對T細胞活化的影響（±s）Tab.7 Effect of 3oc on T cell activation（±s）

Groups PAO1 ΔlasI ΔlasR F P Colony formation 5.23±0.34 2.82±0.21 2.94±0.26 11.373 0.014

3 討論

獨立于Tolllike受體和NOD樣受體的傳統先天感應機制已提出幾種基于蛋白的HSL信號轉導機制，其中轉錄因子X-box結合蛋白1可介導內質網應激相關的胱天蛋白酶激活［13-14］。另有研究顯示，3oc可作為調節劑在一定程度上調節PPAR-β/δ和PPAR-γ轉錄活性，后者參與上皮細胞炎癥反應［15］。本研究提出了一種獨立于直接蛋白相互作用的機制，結果表明，細菌代謝產物可通過膜干擾改變哺乳動物細胞表面，誘導部分細胞凋亡。

3oc誘導的免疫細胞凋亡效果顯著，效果強于TNF-α本身觸發的凋亡［16］。本研究表明，20μmol/L 3oc可誘導細胞凋亡。盡管3oc濃度在機體感染部位較高，如在生物膜上可達數百μmol/L，但可能形成擴散梯度，最終在多數環境下測得的濃度都不超過10μmol/L。對氧磷酶2（para-oxonase-2，PON2）是一種攻擊HSL內酯環的內酯酶，在部分細胞中的表達可顯著降低3oc的促凋亡作用［17］。本研究小鼠模型證實，趨化性吸引至感染部位的淋巴細胞可能暴露于比多數臨床測量值高的3oc水平。銅綠假單胞菌中，Las和Rhl群體感應可調節至少600個細菌基因［18］。本研究表明，小鼠急性肺部感染模型中，3oc至關重要，可作為獨立毒力因子，但其他群體感應基因也可能導致銅綠假單胞菌感染。

膜結構域在真核細胞中具有特異性，其功能發揮依賴于鞘脂和膽固醇的微型晶體狀聚集［19］。盡管研究已發現結構相關的類胡蘿卜素，但細菌卻不含膽固醇和大多數真核固醇。膜結構域在更高的順序上與多種飽和磷脂結合，動態脂質結構域形成柵欄樣排列，受長鏈磷脂上黏附的潛在皮質細胞骨架制約［20］。該分區為高度多樣化的真核表面受體信號傳導提供了通用平臺，使得真核膜對脂質結構域破壞特別敏感。既往粗粒度模型研究多采用由飽和/不飽和磷脂和膽固醇形成的膜中的芳香族和脂肪族疏水分子，該膜在室溫下表現出典型的有序與無序相分離，研究顯示芳族化合物可穩定相分離，而脂族結構可通過破壞其邊界促進脂質域混合，因此，具有12個碳的側鏈HSL屬于后者，與本研究結論相符。細菌群體感應自動誘導劑是釋放的小化學物質，用于控制微生物群落行為。N-（3-氧代十二烷酰基）高絲氨酸內酯是銅綠假單胞菌lasIlasR電路的自誘導物，可引發淋巴細胞大量凋亡。本研究發現該分子被并入哺乳動物的質膜并誘導真核脂質結構域溶解。腫瘤壞死因子受體1因其無配體的自發三聚作用而進入無序脂質相，并引發caspase-3、caspase-9介導的凋亡。銅綠假單胞菌釋放N-（3-氧代十二烷酰基）高絲氨酸內酯以抑制宿主免疫功能，從而更好地存活。相反，阻斷胱天蛋白酶可顯著降低感染嚴重程度，揭示微生物與哺乳動物宿主間未知的交流方法，提示可通過攔截群體感應信號治療細菌感染。

本研究認為，“群集感應”是指細菌特有的，因受到個體數量影響而“開啟”或“關閉”的轉錄調控機制。綠膿桿菌中，存在一類稱為“N-oxo-dodecanoyl-L-Ho?moserine lactone（3oc）”的親脂性群集感應分子。既往研究發現，該分子除在細菌內部具有轉錄調控活性外，還可直接影響宿主信號傳導，主要分為抑制免疫信號及促進細胞凋亡2個方面。3oc的促凋亡作用是其“免疫調節”活性的本質，3oc通過插入及改變細胞膜的有序度影響TNFR1的膜運動特性，從而促進TN?FR1及下游caspase-9與caspase-3激活，引發細胞凋亡，而3oc引發的中性粒細胞凋亡有助于抑制宿主天然免疫反應及促進綠膿桿菌體內增殖。

綜上所述，3oc可通過直接引發宿主自身的TN?FR1信號抑制免疫反應治療銅綠假單胞菌感染，揭示了直接與宿主細胞防御信號轉導偶聯的自動誘導劑的免疫調節機制，即細菌脂類分子可通過改變膜結構間接導致宿主細胞受體分子激活，揭示了細胞膜受體激活的新方式，為調節宿主固有免疫力及微生物代謝產物研究提供了重要線索。