抑制HMGB1對心肌梗死大鼠模型心肌纖維化的影響及機(jī)制研究①

張 妍 田立群 馮 瑩 張盈盈 王代宗 易春峰（武漢市第一醫(yī)院心內(nèi)科，武漢 430022）

心肌梗死（myocardial infarction，MI）是心肌衰竭的主要病因之一，MI后心肌組織由于長時間缺血、缺氧導(dǎo)致?lián)p傷甚至死亡，目前，MI是全球高發(fā)病率和高死亡率的疾病之一［1］。缺血所致MI的標(biāo)準(zhǔn)治療方法為再灌注，但缺血后再灌注對心肌組織具有一定損傷［2］。心肌缺血后心臟會進(jìn)行心室重塑，細(xì)胞外膠原基質(zhì)不斷沉積，成纖維細(xì)胞增殖，導(dǎo)致心肌細(xì)胞肥大、心肌纖維化及細(xì)胞凋亡［3］。壞死的心肌細(xì)胞在缺血環(huán)境中被動釋放高遷移率族蛋白B1（high mobility group protein B1，HMGB1），研究表明，HMGB1是心肌缺血再灌注（myocardial ischemia and reperfusion，I/R）后炎癥反應(yīng)的早期介質(zhì)，而炎癥反應(yīng)可促進(jìn)心肌纖維化［4-5］。本研究擬通過阻斷HMGB1探討其對MI引起的心肌纖維化的保護(hù)作用及機(jī)制，以期為治療MI引起的心肌纖維化提供新靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 雄性SD大鼠15只，體重250～300 g，由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供，合格證號：42000600032585，設(shè)施使用證號：00276883。

1.1.2 試劑HMGB1抑制劑glycyrrhizin購自MEC；戊巴比妥鈉麻醉劑購自Sigma merck；Ⅰ型膠原蛋白（collagenⅠ，COL-Ⅰ）抗體和轉(zhuǎn)化生長因子β 1（transforming growth factor beta1，TGF-β1）抗體購自Abcam；MaxVisionTMHRP-Polymer anti-Mouse/Rab?bit IHC Kit二抗購自邁新；DAB染色試劑盒、HMGB1抗體、基質(zhì)金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）抗體、Toll樣受體4（toll-like receptors，TLR4）抗體、p-NF-κB抗體、NF-κB、GAPDH抗體和Goat Anti-Rabbit IgG抗體購自武漢Bioswamp。

1.1.3 儀器Bw-bm1103小動物呼吸機(jī)（上海軟隆科技發(fā)展有限公司）；SZM45-STL1體視顯微鏡（舜宇光學(xué)科技有限公司）；IMAC300VET心電圖儀（武漢中旗）；DM1000正置顯微鏡（徠卡顯微系統(tǒng)有限公司）；mini protean 3 cell電泳儀（BIO-RAD）；MK3酶標(biāo)儀（芬蘭雷勃）；Tanon-5200全自動化學(xué)發(fā)光分析儀（上海天能）。

1.2 方法

1.2.1 造模及分組15只大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組和HMGB1抑制組，每組5只。正常組大鼠不做任何處理，模型組和HMGB1抑制組大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉（30 mg/kg）進(jìn)行麻醉，呼吸機(jī)輔助呼吸通過氣管插管進(jìn)行，呼吸頻率調(diào)節(jié)至50次/min，潮氣量20 ml/kg，采用肢體皮下插入針電極方式沿胸骨左緣開胸，于3、4肋間行縱向切口，剪斷肋骨，破胸膜、心包膜，在左冠狀動脈前降支起始部采用6-0針線穿過心肌淺層，穿入直徑為2 mm的聚乙烯管，穩(wěn)定1 min后抽緊絲線，阻斷冠脈血流。缺血處理30 min后松開絲線與聚乙烯管，恢復(fù)血流灌注。HMGB1抑制組于IR前5 min進(jìn)行第1次給藥，靜脈注射HMGB1抑制劑［10 mg/（kg·d）］，每24 h給藥1次，連續(xù)給藥21 d，模型組靜脈注射等量生理鹽水［6］。

1.2.2 HE染色觀察心肌組織病理情況 將脫水完成的樣本進(jìn)行石蠟包埋和石蠟切片，60℃烘干，常規(guī)脫蠟至水，水洗3～5 min，蘇木素染色3～5 min，0.5%鹽酸分化液分化數(shù)秒，水洗后返藍(lán)液返藍(lán)，流水洗去返藍(lán)液，伊紅染色5 min，流水沖洗數(shù)秒，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。

1.2.3 Masson染色觀察心肌組織纖維化程度 石蠟切片常規(guī)脫蠟至水后流水沖洗1～3 min，配制蘇木素染色液和三氯化鐵水溶液等量混合溶液，滴加至有組織切片染色5 min，鹽酸乙醇分化液分化、水洗，返藍(lán)，水洗，蒸餾水洗1 min，酸性品紅染色5～10 min，乙酸水溶液洗1 min，磷鉬酸水溶液洗1～2 min，乙酸水溶液洗1 min，苯胺藍(lán)染色液染色1～2 min，乙酸水溶液洗1 min，梯度乙醇快速脫水，二甲苯透明3次，1～2 min/次，中性樹膠封固，顯微鏡下觀察，自動圖像分析儀定量測定間質(zhì)膠原含量。

1.2.4 Western blot檢測COL-Ⅰ、MMP2、TGF-β1、HMGB1、TLR4、p-NF-κB/NF-κB表達(dá) 提取蛋白后進(jìn)行蛋白定量，同時配制SDS-PAGE膠，上樣，以濃縮膠80 V 40 min，分離膠120 V 50 min進(jìn)行電泳，染料到達(dá)底部時終止電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，按照說明書稀釋一抗，4℃孵育過夜。孵育一抗的膜用PBST洗3次，5 min/次，稀釋HRP標(biāo)記的二抗（1：10 000），室溫孵育1 h，PBST洗3次，5 min/次，暗室中將ECL發(fā)光液A和B等量混勻，加在膜的正面與之充分接觸，全自動化學(xué)發(fā)光分析儀中檢測，TANON GIS軟件讀取相關(guān)條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，數(shù)據(jù)以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MI模型鑒定 模型構(gòu)建時大鼠aVF導(dǎo)聯(lián)心電圖見圖1，與正常組相比，ST段明顯抬高，提示造模成功。

圖1 大鼠Ⅱ?qū)?lián)心電圖觀察Fig.1 Observation of Ⅱlead electrocardiagram

2.2 HMGB1抑制對MI大鼠病理形態(tài)的影響HE染色結(jié)果顯示，正常組大鼠心肌組織未見明顯病理變化，心肌組織結(jié)構(gòu)清晰，心肌纖維排列整齊，結(jié)果完整，心肌纖維極少斷裂，心肌細(xì)胞間質(zhì)未見水腫。模型組大鼠心肌組織呈纖維化，細(xì)胞核不規(guī)則，呈濃縮狀，有炎癥細(xì)胞浸潤，部分肌纖維變形，間質(zhì)水腫，心肌組織排列紊亂，心肌纖維廣泛變性、斷裂，HMGB1抑制組大鼠心肌排列稍有紊亂，炎癥細(xì)胞浸潤及間質(zhì)水腫減輕（圖2）。

圖2 HE染色觀察大鼠心肌組織病理變化（×20）Fig.2 Pathological change of myocardial tissue in rats by HE staining（×20）

圖3 Masson染色觀察大鼠心肌組織纖維化程度（×20）Fig.3 Degree of myocardial tissue fibrosis in rats by Mas-son staining（×20）

2.3 HMGB1抑制對MI大鼠心肌纖維化的影響各組大鼠心肌組織Masson染色結(jié)果顯示，細(xì)胞核被染成藍(lán)色，胞漿、肌肉及紅細(xì)胞被染成紅色，間質(zhì)膠原纖維被染成藍(lán)色。與正常組相比，模型組和HMGB1抑制組大鼠心肌膠原含量明顯增加（P＜0.05），與模型組相比，HMGB1抑制組大鼠心肌膠原含量減少，纖維化程度明顯減輕（P＜0.05，圖3）。

2.4 各組大鼠心肌組織COL-Ⅰ、MMP-2和TGF-β1蛋白表達(dá) 模型組大鼠心肌組織COL-Ⅰ、MMP-2和TGF-β1蛋白表達(dá)較正常組顯著提高（P＜0.05），而HMGB1抑制組大鼠心肌組織COL-Ⅰ、MMP-2和TGF-β1蛋白表達(dá)較模型組顯著降低（P＜0.05，圖4）。

圖4 Western blot觀察大鼠心肌組織中COL-Ⅰ、MMP-2、TGF-β1表達(dá)Fig.4 Western blot to observe expressions of COL-Ⅰ，MMP-2 and TGF-β1 in rat myocardium

2.5 HMGB1抑制對TLR4/NF-κB信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與對照組相比，模型組和HMGB1抑制組大鼠HMGB1、TLR4和p-NF-κB蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.05），與模型組相比，HMGB1抑制組HMGB1、TLR4和p-NF-κB蛋白明顯降低（P＜0.05，圖5）。

圖5 Western blot檢測大鼠心肌組織HMGB1、TLR4和p-NF-κB蛋白表達(dá)Fig.5 Protein expressions of HMGB1，TLR4 and p-NFκB in rat myocardium detected by Western blot

3 討論

MI后心肌細(xì)胞由于缺氧導(dǎo)致?lián)p傷甚至凋亡，心肌重塑導(dǎo)致心衰，影響心臟功能，導(dǎo)致機(jī)體生命活動受限甚至死亡。心肌纖維化是多數(shù)心血管疾病進(jìn)展的主要原因，通常引起心肌和血管壁結(jié)構(gòu)變化［7］。心肌纖維化過程中，COL-Ⅰ合成增加，心臟僵硬度提高，導(dǎo)致順應(yīng)性降低和舒張充盈下降［8］。研究表明，MMP-2參與心肌組織纖維化過程，TGF-β及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑積極參與心肌細(xì)胞凋亡及心肌肥大，是導(dǎo)致心肌纖維化的關(guān)鍵因素，三者均參與心肌組織纖維化過程［9-10］。本研究發(fā)現(xiàn)，阻斷后HMGB1，大鼠心肌組織COL-Ⅰ、MMP-2和TGF-β1表達(dá)較模型組明顯下降，表明抑制HMGB1可對心肌組織纖維化具有一定保護(hù)作用。

I/R過程中釋放大量免疫原性代謝產(chǎn)物，激活先天免疫系統(tǒng)細(xì)胞，上調(diào)浸潤性炎癥反應(yīng)［11］。炎癥反應(yīng)在心肌組織纖維化過程中發(fā)揮促進(jìn)作用，可刺激心肌膠原纖維異常增多，導(dǎo)致心肌重塑［5］。本研究通過抑制HMGB1發(fā)現(xiàn)，大鼠心肌組織炎癥浸潤及心肌細(xì)胞水腫明顯減輕，心肌膠原纖維含量明顯減少。HMGB1誘導(dǎo)細(xì)胞因子釋放和促炎過程中的主要受體是TLR4，兩者結(jié)合激活核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB信號通路，促進(jìn)炎癥因子表達(dá)，I/R炎癥反應(yīng)主要由HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路引起［12-13］。本研究證實(shí)，MI后HMGB1蛋白在心肌組織中表達(dá)明顯增高，TLR4和p-NF-κB蛋白表達(dá)變化與HMGB1蛋白表達(dá)一致，而阻斷HMGB1后3個蛋白表達(dá)較模型組下降。研究表明，血管緊張素Ⅱ（angiotensinⅡ，AngⅡ）可誘導(dǎo)分泌COL-Ⅰ［14］。而TLR4/NF-κB信號通路活化可降低AngⅡ水平，進(jìn)而降低COL-Ⅰ表達(dá)［15］。下調(diào)TLR4/NF-κB/TGF-β1通路可減輕阿霉素大鼠腎纖維化［16］，證明TGF-β1這一多功能細(xì)胞因子與TLR4/NF-κB信號通路共同調(diào)節(jié)纖維化過程。因此，推測阻斷HMGB1通過影響TLR4/NF-κB信號通路減輕心肌炎癥反應(yīng)進(jìn)而抑制心肌纖維化，保護(hù)心肌。

綜上所述，HMGB1阻斷可減輕MI導(dǎo)致的纖維化，可能通過影響TLR4/NF-κB信號通路進(jìn)而減輕炎癥反應(yīng)實(shí)現(xiàn)。