桔梗總皂苷對膠原性關節炎大鼠的抗炎作用及對TLR/MyD88/NF-κB通路的影響①

何曉麗 鐘先錦 龔菊梅 劉修樹（合肥職業技術學院生物工程學院，合肥 238000）

類風濕性關節炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種自身免疫性疾病，以關節滑膜慢性炎癥為主［1］。在RA的發病過程中，Toll樣受體4/髓樣分子因子88/核因子-κB（TLR/MyD88/NF-κB）信號通路介導的炎癥反應在RA的發病過程中發揮重要作用，阻斷由NF-κB信號通路介導的炎癥反應可防治RA的發生發展［2-3］。桔梗是常見的一種藥用植物，桔梗總皂苷是其主要活性成分，具有抗病毒、抗炎、調節免疫、抗腫瘤、保肝等多種藥理作用，在肺部疾病和炎癥相關性疾病中具有一定治療作用［4-5］。桔梗總皂苷可通過抑制NF-κB信號通路發揮抗炎作用，如董雙勇等［6］研究發現桔梗總皂苷通過抑制NF-κB的表達抑制急性肺損傷大鼠體內的炎癥反應，發揮對急性肺損傷的保護作用。陳昭琳等［7］研究發現桔梗總皂苷通過抑制內質網應激發揮對RA大鼠的治療作用。考慮NF-κB信號通路介導的炎癥反應在RA發病過程中發揮重要作用，桔梗總皂苷具有抗炎和抑制NF-κB信號通路的作用，本課題組對桔梗總皂苷對膠原性關節炎大鼠的抗炎作用及對TLR/MyD88/NF-κB通路的影響進行研究，探討桔梗總皂苷在抑制RA炎癥反應的作用及可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 清潔級、體重150～180 g、6～8周齡、Wistar大鼠購自北京醫療器械檢驗所，許可證號：SYXK（京）2015-0005。

1.1.2 主要試劑與儀器 桔梗總皂苷（上海源葉生物科技有限公司，純度98.2%），牛Ⅱ型膠原、完全弗氏佐劑（美國Chondrex公司）；IL-1β、IL-6、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）ELISA試劑盒（上海酶聯科技有限公司）；伊紅、蘇木素、蛋白裂解液（RIPA）（上海碧云天生物技術有限公司），兔抗鼠TLR2單克隆抗體、兔抗鼠TLR4單克隆抗體、兔抗鼠MyD88單克隆抗體、兔抗鼠p-NF-κB p65單克隆抗體、兔抗鼠NFκB單克隆抗體（美國Invitrogen公司）；BH-2型OLYMPUS顯微鏡（日本Olympus公司）等。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 取70只大鼠，根據隨機數字表法分為對照組、模型組、CKS低劑量組、CKS高劑量組、雷公藤多苷組，每組14只。

1.2.2 膠原性關節炎大鼠模型建立 除對照組外，其他各組建立膠原性關節炎大鼠模型，具體方法為［8］：將10 ml牛Ⅱ型膠原（2 mg/ml）和等體積完全弗氏佐劑混合均勻，制成乳劑，備用。采用水合氯醛腹腔麻醉大鼠，麻醉成功后剪去大鼠尾根部和背部毛，皮內多點注射0.25 mg牛Ⅱ型膠原乳劑，1周后再次注射，首次注射2周后，關節炎指數≥4為造模成功。對照組大鼠采用同樣方法注射等量生理鹽水。

1.2.3 處理方法 造模成功后，CKS低劑量組和高劑量組大鼠分別給予CKS 100 mg/kg和200 mg/kg灌胃［7］，雷公藤多苷組大鼠給予雷公藤多苷12 mg/kg灌胃作為陽性對照組，對照組和模型組給予等量生理鹽水灌胃。共12 d。

1.2.4 關節炎指數計算 所有大鼠于建模前、建模后、給藥28 d時觀察關節炎嚴重程度變化。0分：未見腫脹；1分：足趾關節微見腫脹；2分：足趾關節和小趾關節可見腫脹；3分：踝關節以下足爪見腫脹；4分：包括踝關節在內的全部關節腫脹。關節炎指數=4只肢體關節評分之和，最高分16分，≥4分為造模成功。對于造模失敗大鼠，取正常大鼠重新造模，取造模成功者補充上述造模失敗大鼠。

1.2.5 標本采集 于給藥第28天時處死大鼠，取大鼠右踝關節，用多聚甲醛固定，硝酸溶液脫鈣，脫水，石蠟包埋，切成厚0.4μm切片，用于HE和免疫組化染色檢測；取大鼠左踝關節，切取滑膜組織，用于ELISA和Western blot檢測。

1.2.6 HE染色 取大鼠踝關節切片組織，常規進行HE染色，光鏡下觀察大鼠踝關節組織病理學變化。

1.2.7 踝關節滑膜組織中IL-1β、IL-6、TNF-α水平 取大鼠踝關節滑膜組織，剪碎、勻漿，8 000 r/min離心12 min，取上清液，再12 000 r/min離心30 min，采用ELISA法測定IL-1β、IL-6、TNF-α水平，實驗步驟嚴格按照說明書進行。

1.2.8 滑膜組織TLR2、TLR4、MyD88、p-NF-κB p65蛋白水平測定 取大鼠滑膜組織，加入EP管中，加入1 ml RIPA裂解液和10μl蛋白酶抑制劑混合，裂解30 min，12 000 r/min離心15 min，取上清液，采用Western blot測定滑膜組織TLR2、TLR4、MyD88、p-NF-κB p65蛋白水平。經常規電泳、轉膜、封閉，加入一抗：兔抗鼠TLR2單克隆抗體、兔抗鼠TLR4單克隆抗體、兔抗鼠MyD88單克隆抗體、兔抗鼠p-NFκB p65單克隆抗體，稀釋比例1∶300，過夜孵育，加入二抗（1∶2 000）孵育1 h，采用增強化學發光法檢測，采用Image J軟件測定蛋白條帶灰度值。以βactin為內參，目標蛋白水平以目標蛋白條帶灰度值/β-actin條帶灰度值。

1.3 統計學分析 采用SPSS20.0軟件進行分析，各組大鼠關節炎指標、踝關節滑膜組織中IL-1β、IL-6、TNF-α水 平、踝關節滑膜組織TLR2、TLR4、MyD88、p-NF-κB p65蛋白水平、踝關節滑膜組織NFκB蛋白IOD值經檢驗均符合正態分布，以±s表示，各組之間比較采用單因素方差分析，組內兩兩比較采用LSD檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠關節炎指標值比較0 d時，各組大鼠關節炎指數差異無統計學意義（P＞0.05）；其他各時間點各組大鼠關節炎指數差異均有統計學意義（P＜0.05），與模型組比較，CKS組大鼠關節炎指數降低，且呈劑量依賴性。見表1。

表1 各組大鼠關節炎指數值比較（±s，n=14）Tab.1 Comparison of arthritis index values of rats in each group（±s，n=14）

表1 各組大鼠關節炎指數值比較（±s，n=14）Tab.1 Comparison of arthritis index values of rats in each group（±s，n=14）

Note：Compared with model group，1）P＜0.05.

35 d 10.35±0.91 7.52±0.931）6.89±0.871）6.65±0.911）49.659 0.000 Groups Model CKS low dose CKS high dose Tripterygium wilfordii F P 0 d 9.31±1.12 9.27±0.98 9.23±1.32 9.24±1.25 0.013 0.998 7 d 11.12±1.17 9.93±1.141）9.44±1.121）9.39±1.181）6.818 0.000 14 d 10.65±1.01 9.47±1.061）8.68±1.211）8.61±1.171）10.130 0.000 28 d 10.57±0.93 8.67±0.881）7.23±0.921）7.14±0.971）42.155 0.000

2.2 各組大鼠踝關節滑膜組織HE染色 對照組大鼠踝關節結構清晰完整，滑膜組織表層滑膜細胞排列整齊，關節面和滑膜層平整光滑，關節腔無增生纖維組織，關節骨組織和軟骨組織結構完整；模型組大鼠踝關節結構異常，出現增生性滑膜炎表現，滑膜細胞增生、排列紊亂，滑膜組織有大量炎癥細胞浸潤，滑膜下層血管充血擴張，形成血管翳，關節腔中纖維結締組織增生，關節腔隙變窄，關節骨組織和軟骨組織破壞；CKS低劑量組大鼠踝關節結輕，滑膜下結締組織中度充血，關節腔隙變窄減輕，關節骨組織和軟骨組織被破壞程度減輕；CKS高劑量組大鼠踝關節結構破壞顯著減輕，滑膜細胞增生顯著減少，少量炎癥細胞浸潤，滑膜下結締組織輕度充血，關節骨組織和軟骨組織破壞較輕。見圖1。

圖1 各組大鼠踝關節滑膜組織HE染色（×40）Fig.1 HE staining of synovial tissue of ankle joint of rats in each group（×40）

2.3 各組大鼠踝關節滑膜組織中IL-1β、IL-6、TNF-α水平比較 各組大鼠踝關節滑膜組織中IL-1β、IL-6、TNF-α水平差異有統計學意義（P＜0.05），與對照組比較，模型組大鼠踝關節滑膜組織中IL-1β、IL-6、TNF-α水平升高；與模型組比較，CKS各劑量組大鼠踝關節滑膜組織中IL-1β、IL-6、TNF-α水平降低。見表2。

表2 各組大鼠踝關節滑膜組織中IL-1β、IL-6、TNF-α水平比較（±s，n=14）Tab.2 Comparison of IL-1β，IL-6 and TNF-αlevels in synovial tissue of rats in each group（±s，n=14）

表2 各組大鼠踝關節滑膜組織中IL-1β、IL-6、TNF-α水平比較（±s，n=14）Tab.2 Comparison of IL-1β，IL-6 and TNF-αlevels in synovial tissue of rats in each group（±s，n=14）

Note：Compared with control group，1）P＜0.05；compared with model group，2）P＜0.05.

TNF-α（ng/L）127.59±21.43 352.46±28.711）171.43±27.541）2）157.38±33.511）2）154.29±31.241）2）139.202 0.000 Groups Control Model CKS low dose CKS high dose Tripterygium wilfordii F P IL-1β（ng/L）31.24±5.03 102.37±6.421）55.42±6.281）2）38.24±5.861）2）36.58±6.021）2）337.435 0.000 IL-6（ng/L）43.52±6.26 75.43±7.021）54.16±7.021）2）47.98±7.241）2）46.57±7.131）2）47.885 0.000

2.4 各組大鼠踝關節滑膜組織TLR2、TLR4、MyD88、p-NF-κB p65蛋白水平比較 各組大鼠踝關節滑膜組織TLR2、TLR4、MyD88、p-NF-κB p65蛋白水平比較差異有統計學意義（P＜0.05），與對照組比較，模型組大鼠踝關節滑膜組織TLR2、TLR4、MyD88、p-NF-κB p65蛋白水平升高；與模型組比較，CKS各劑量組大鼠踝關節滑膜組織TLR2、TLR4、MyD88、p-NF-κB p65蛋白水平降低。見表3、圖2。

表3 各組大鼠踝關節滑膜組織TLR2、TLR4、MyD88、p-NF-κB p65蛋白水平比較（±s，n=14）Tab.3 Levels of TLR2，TLR4，MyD88 and p-NF-κB p65 protein in synovial tissues of rats in each group（±s，n=14）

表3 各組大鼠踝關節滑膜組織TLR2、TLR4、MyD88、p-NF-κB p65蛋白水平比較（±s，n=14）Tab.3 Levels of TLR2，TLR4，MyD88 and p-NF-κB p65 protein in synovial tissues of rats in each group（±s，n=14）

Note：Compared with control group，1）P＜0.05；compared with model group，2）P＜0.05.

p-NF-κB p65 0.11±0.03 0.83±0.091）0.32±0.051）2）0.14±0.021）2）0.15±0.031）2）499.023 0.000 Groups Control Model CKS low dose CKS high dose Tripterygium wilfordii F P TLR2 0.09±0.03 0.43±0.061）0.24±0.051）2）0.13±0.031）2）0.14±0.021）2）157.964 0.000 TLR4 0.07±0.02 0.55±0.071）0.29±0.061）2）0.21±0.041）2）0.19±0.031）2）197.228 0.000 MyD88 0.13±0.03 0.62±0.081）0.28±0.061）2）0.15±0.021）2）0.16±0.031）2）241.959 0.000

3 討論

桔梗為桔梗科植物桔梗的干燥根，為常用中藥之一，具有排膿、祛痰、利咽、宣肺等功效［9-10］。桔梗中含有大量皂苷，皂苷是桔梗藥理活性的主要成分［11］。近年研究發現桔梗總皂苷具有抗炎作用，如姚琳等［12］研究發現桔梗總皂苷可通過抑制炎癥細胞因子引起的肺組織炎癥反應，從而達到抑制肺纖維化進程，發揮對急性肺損傷大鼠的保護作用；CHOI等［13］研究發現桔梗總皂苷具有減輕氣道炎癥的作用。RA為一種炎癥性疾病，滑膜中炎癥細胞因子水平升高［14］。本研究通過建立RA大鼠模型，發現大鼠關節炎指數升高，踝關節滑膜組織中IL-1β、IL-6、TNF-α水平升高，HE染色顯示大鼠踝關節滑膜組織出現增生性滑膜炎表現。RA大鼠踝關節中炎癥細胞因子水平升高，炎癥反應在RA發病中發揮重要作用。RA大鼠給予低劑量和高劑量桔梗總皂苷治療后，大鼠關節炎指數降低，踝關節滑膜組織中IL-1β、IL-6、TNF-α水平降低，HE染色顯示大鼠踝關節滑膜組織出現增生性滑膜炎表現明顯減輕，且呈現劑量依賴性。本研究結果和上述研究結果一致，表明桔梗總皂苷具有抗炎作用，在RA中可通過抑制炎癥反應發揮治療作用。

本研究結果顯示：模型組大鼠踝關節滑膜組織TLR2、TLR4、MyD88、p-NF-κB p65蛋白水平升高，NF-κB蛋白IOD值升高；給予各劑量桔梗總皂苷干預后，大鼠踝關節滑膜組織TLR2、TLR4、MyD88、p-NF-κB p65蛋白水平降低，NF-κB蛋白IOD值降低。TLR/MyD88/NF-κB信號通路在炎癥反應中發揮重要作用，TLRs參與機體固有免疫反應，TLR2和TLR4是該家族重要成員，在炎癥反應過程中發揮關鍵性作用［15-16］。MyD88為TLRs通路的關鍵分子，通過傳遞TLRs信息，參與炎癥的發生發展過程［17］。TLR2和TLR4可通過相應的配體和MyD88相結合，激活下游NF-κB等轉錄因子，形成活化的NF-κB（p-NF-κB p65為NF-κB的活化形式），啟動炎癥介質表達，誘導IL-1β、IL-6、TNF-α等炎癥細胞因子水平升高［18］。TLR2、TLR4、MyD88、p-NF-κB p65水平升高，表明TLR/MyD88/NF-κB信號通路被激活［19］。在RA發病過程中，TLR/MyD88/NF-κB信號通路介導的炎癥反應發揮重要作用，抑制TLR/MyD88/NFκB信號通路介導的炎癥反應對RA具有保護作用［20］。桔梗總皂苷作為常用中藥，可通過NF-κB通路發揮抗炎作用，如桔梗總皂苷可通過抑制NF-κB介導的炎癥反應改善順鉑誘導的急性腎毒性［21］；桔梗總皂苷可通過抑制NF-κB介導的炎癥反應減輕特應性皮炎樣皮膚損傷［22］。結合既往研究及本研究結果，推測桔梗總皂苷可能通過抑制TLR/MyD88/NF-κB信號通路激活，進而抑制其下游IL-1β、IL-6、TNF-α等炎癥細胞因子表達，抑制炎癥反應，從而發揮對RA的保護作用。

綜上所述，桔梗總皂苷可通過抑制炎癥反應發揮對RA的保護作用，其機制可能與其抑制TLR/MyD88/NF-κB信號通路的激活有關。