芍藥苷對DSS誘導大鼠慢性潰瘍性結腸炎IL-17表達的影響①

司曉麗 王 燁 王 卓 李蘭珍 朱向東 （甘肅中醫藥大學基礎醫學院，蘭州 730000）

潰瘍性結腸炎是一種病因尚不明確的慢性炎性腸病，其發病機制與環境、遺傳、免疫等因素有關［1］。疾病活動期，腸道上皮黏膜屏障破壞，腸道內病原體向固有層轉移，免疫細胞被激活，產生大量TNF-α、IFN-γ、IL-6等促炎細胞因子，誘導上皮細胞凋亡，連接蛋白表達下調，腸上皮通透性增加，加重組織損傷［2］。自噬是真核生物細胞內長半衰期蛋白質的降解途徑，可通過降解受損的細胞器或細胞內的病原體，修復受損的腸上皮，刺激宿主產生防御肽，啟動適應性免疫，維持內環境的穩定，被認為是先天免疫的核心［3］。在DSS誘導的急性UC動物模型中發現自噬相關基因ATG7表達下降，提示腸上皮細胞自噬功能下降，腸道內環境被破壞，導致了腸道先天免疫的異常［4］。

白芍是一種常見的補益藥材，為毛茛科植物芍藥Paeonia lactifloraPall.的根，芍藥苷（Paeoniflorin）是其主要的活性成分，一種單萜糖苷。本團隊前期研究證實芍藥苷能夠調節腸道異常免疫反應，修復TNBS/乙醇液誘導的腸道潰瘍，具有抗炎、免疫調節作用［5］。也有研究報道芍藥苷能夠降低IL-17A、IL-17F及TNF-α等Th17細胞相關因子mRNA的表達，減少病變部位炎細胞浸潤、表皮細胞增殖及異常分化［6］。IL-17是由native CD4+T細胞來源的Th17細胞分泌產生的一種前促炎因子。Meta分析表明IL-17遺傳多態性和血清水平可能與潰瘍性結腸炎風險增加有關，患者外周血IL-17水平顯著升高，且IL-17水平與疾病病變程度顯著相關［7-8］。此外，血清剝奪或雷帕霉素（rapamycin，自噬誘導劑）處理的人表皮Ha?CaT細胞給予100 ng/ml人重組IL-17A刺激后，LC3Ⅱ蛋白水平顯著下降，提示自噬在IL-17A介導的皮膚炎癥中活性下降［9］。在潰瘍性結腸炎中，自噬與IL-17的關系鮮有報道，本研究旨在觀察IL-17及自噬相關因子LC3BⅡ、Beclin1在DSS誘導的UC大鼠模型中的表達水平，探討芍藥苷可能的干預機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物70日齡SPF級雄性Wistar大鼠，40只，體重（200±20）g（購自甘肅中醫藥大學實驗中心，No.62001000000324），飼養于通風、溫度（23±2）℃、相對濕度（55±15）%環境，每日光照12 h，自由攝食飲水。

1.1.2 藥物與試劑DSS購自美國MP公司；芍藥苷（批號：C10010107，含量≥98%）購自上海麥克林生化科技有限公司；柳氮磺吡啶購自上海信宜天平藥業有限公司；兔抗IL-17、LC3B抗體購自GeneTex公司；兔抗Beclin1抗體購自Cell Signaling公司；IL-17、ICAM ELISA試劑盒購自Mibo公司；TNF-αELI?SA試劑盒購自欣博盛生物；SP免疫組化試劑盒購自中山金橋；羊抗兔IgG二抗、β-actin單克隆抗體購自Immuno Way公司；PBS磷酸鹽緩沖液干粉購自Solarbio公司；水合氯醛購自國藥集團化學試劑有限公司；膠體金法大便潛血檢測試劑盒購自鄭州方欣生物科技有限責任公司。

1.2 方法

1.2.1 DSS誘導慢性潰瘍性結腸炎模型的建立 參考文獻［10］制作相關模型，如圖1所示，30只大鼠于第1天開始連續7 d給予添加2%DSS的蒸餾水自由飲用，隨后給予無添加的蒸餾水連續飲用14 d。如圖1所示，上述DSS+蒸餾水飲用進行3個循環。另取10只大鼠給予無添加蒸餾水作為空白對照組。在添加DSS的蒸餾水飲用期每日觀察并記錄大鼠體重、糞便性狀及便血情況。

圖1 慢性潰瘍性結腸炎大鼠模型建立方法Fig.1 Experimental protocol to establish rat model of chronic ulcerative colitis

1.2.2 分組和給藥 區組隨機法將30只造模成功大鼠分為DSS組、DSS+芍藥苷組和DSS+柳氮磺吡啶組，每組10只大鼠。其中，柳氮磺吡啶作為陽性對照。按照人與動物用藥劑量折算成大鼠用藥量，芍藥苷根據前期研究自造模后第1天開始2.5 g/（kg·d）灌胃［5］，柳氮磺吡啶0.5 g/（kg·d）灌胃，空白對照組以及DSS組給予等體積生理鹽水灌胃，隔天灌胃給藥1次，各組連續給藥干預21 d。

1.2.3 DAI評分 參照文獻［11］，計算各組大鼠每輪添加DSS的蒸餾水飲用后DAI的值（DAI=體重減輕指數+糞便形狀指數+便血指數），評分標準見表1。

表1 DAI評分標準Tab.1 DAI scoring criteria

1.2.4 ELISA法檢測外周血IL-17、TNF-α及ICAM的含量 新鮮配制7%水合氯醛400 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，腹腔靜脈抗凝采血，2 000 r/min離心15 min，收集血漿，按照說明書要求，將血漿、ELISA試劑于室溫下平衡30 min；酶標板中，設空白孔，孔內加100μl標準品&標本稀釋液；設反應孔，每孔內加入100μl標本或不同濃度標準品，封板膠紙封住反應孔37℃孵育90 min；洗板5次；空白孔內加入100μl生物素化抗體稀釋液，反應孔內加入100μl生物素化抗體工作液，37℃繼續孵育60 min；洗板5次；空白孔加入100μl酶結合稀釋液，反應孔內加入100μl酶結合工作液，37℃繼續孵育30 min；洗板5次；每孔加入100μl的TMB顯色，避光37℃繼續孵育15 min；每孔加入100μl終止液終止反應，酶標儀450 nm讀板并記錄數據，ELISACalc.exe回歸/擬合計算軟件V0.1計算樣本IL-17、TNF-α及ICAM的含量。

1.2.5 免疫組化法檢測結腸組織IL-17蛋白表達 取病變腸組織縱行切開，預冷生理鹽水沖洗腸道，病變嚴重段置于10%福爾馬林固定，常規石蠟包埋結腸組織并連續切片，脫蠟水化，pH6.0枸櫞酸鹽緩沖液抗原修復，5%BSA 37℃孵育30 min，加入適當比例稀釋的一抗（IL-17 1∶100），置于4℃冰箱過夜。次日37℃復溫45 min，加入生物素標記的二抗，室溫下孵育30 min，DAB顯色，蘇木精復染20 min，中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察并攝片，Image J圖像分析軟件測定IL-17陽性區域平均吸光度值。

1.2.6 Western blot法檢測結腸組織IL-17、LC3B、Beclin1蛋白水平 取各組結腸組織剪碎，置于預冷的破璃容器中，加入裂解液制備組織勻漿，12 000 r/min離心5 min，取上清測定蛋白濃度。各組分別取等量蛋白上樣，經電泳分離后，PVDF膜300 mA恒流轉膜，5%脫脂奶粉封閉2 h；加一抗（IL-17 1：2 000、LC3B 1：1 000、Beclin1 1：2 000），4℃冰箱過夜。次日，PBST洗膜4次，每次8 min；避光條件下敷二抗輕搖2 h，PBST洗膜4次，每次8 min；加ECL發光液，化學發光成像儀（上海勤翔科學儀器有限公司）曝光拍照，Image J圖像分析軟件分析條帶灰度值，以β-actin為內參計算IL-17、LC3B、Beclin1的相對蛋白表達量。

1.3 統計學分析 采用SPSS23.0統計軟件包進行統計處理，所有指標均以±s表示，組間差異比較采用方差分析，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 芍藥苷對DAI評分的影響 空白對照組大鼠飲食、飲水尚可，未見明顯體重下降及血便，偶有軟便。DSS組大鼠隨著DSS飲用時間的增長，大鼠食納減少，毛色粗糙，體重顯著下降，糞便軟散或便溏，次數增加，肛周污濁，嚴重者肉眼可見血便，未出現死亡，DAI評分結果見表2，結果顯示與空白對照組相比，DAI評分顯著增高（P＜0.01）。與DSS組大鼠相比，治療組大鼠DAI評分顯著降低（P＜0.05），食納及體重增加，便溏及血便減少。

表2 各組大鼠DAI評分（±s，n=10）Tab.2 DAI scores of rats in each group（±s，n=10）

表2 各組大鼠DAI評分（±s，n=10）Tab.2 DAI scores of rats in each group（±s，n=10）

Note：Compared with control group，1）P＜0.05，2）P＜0.01；compared with DSS group，3）P＜0.01.

Third round 0.3±0.93）9.7±2.02）4.1±2.92）3）3.5±2.42）3）Groups Control DSS DSS+Paeoniflorin DSS+Sulfasalazine First round 0.4±0.83）4.7±1.62）2.4±1.72）3）1.9±1.31）3）Second round 0.5±1.13）7.8±1.82）3.8±2.12）3）3.2±1.92）3）

2.2 芍藥苷對外周血IL-17、TNF-α及ICAM含量的影響ELISA結果如表3所示：與空白對照組相比，DSS組大鼠外周血中IL-17、TNF-α及ICAM含量顯著升高（P＜0.01）。與DSS組相比，DSS+芍藥苷組、DSS+柳氮磺吡啶組大鼠外周血IL-17、TNF-α及ICAM含量顯著降低（P＜0.05）。

表3 ELISA檢測外 周血IL-17、TNF-α及ICAM的含量（±s，n=10）Tab.3 Levels of IL-17，TNF-αand ICAM in peripheral blood were detected by ELISA（±s，n=10）

表3 ELISA檢測外 周血IL-17、TNF-α及ICAM的含量（±s，n=10）Tab.3 Levels of IL-17，TNF-αand ICAM in peripheral blood were detected by ELISA（±s，n=10）

Note：Compared with control group，1）P＜0.05，2）P＜0.01；compared with DSS group，3）P＜0.05，4）P＜0.01.

ICAM（pg/ml）107.4±10.44）212.5±11.52）151.3±19.81）4）128.4±16.51）4）Groups Control DSS DSS+Paeoniflorin DSS+Sulfasalazine IL-17（pg/ml）71.6±7.44）135.3±13.72）94.2±10.11）4）81.0±15.94）TNF-α（pg/ml）68.3±9.14）119.3±15.12）95.7±19.01）3）83.5±19.44）

2.3 芍藥苷對大鼠結腸組織IL-17蛋白表達的影響 免疫組化結果如圖2所示，IL-17陽性表達主要見于黏膜層細胞的胞漿內，細胞間質及細胞核未見明顯表達。Image J圖像分析軟件結果如表4所示，與空白對照組相比，DSS組大鼠結腸組織IL-17陽性區域吸光度值顯著增加（P＜0.01）。與DSS組相比，DSS+芍藥苷組、DSS+柳氮磺吡啶組大鼠結腸組織IL-17陽性區域吸光度值顯著降低（P＜0.01）。

圖2 免疫組化測定芍藥苷對結腸組織IL-17蛋白表達水平的影響（×200）Fig.2 Effect of paeoniflorin on expression of IL-17 pro-tein in colon tissues was determined by immunohis-tochemistry（×200）

表4 結腸組織IL-17陽性區域吸光度值（±s，n=10）Tab.4 Absorbance value of IL-17 positive area in colon-tissue（±s，n=10）

表4 結腸組織IL-17陽性區域吸光度值（±s，n=10）Tab.4 Absorbance value of IL-17 positive area in colon-tissue（±s，n=10）

Note：Compared with control group，1）P＜0.05，2）P＜0.01；Compared with DSS group，3）P＜0.01.

Absorbance value 0.273±0.0783）0.354±0.0312）0.251±0.1093）0.237±0.0241）3）Groups Control DSS DSS+Paeoniflorin DSS+Sulfasalazine

2.4 芍藥苷對大鼠結腸組織IL-17、LC3B、Beclin1蛋白水平的影響Western blot結果如圖3、表5所示，與空白對照組相比，DSS組結腸組織IL-17蛋白水平顯著增加，LC3BⅡ及Beclin1蛋白水平降低（P＜0.01）；與DSS組相比，DSS+芍藥苷組和DSS+柳氮磺吡啶組結腸組織IL-17蛋白水平顯著降低（P＜0.01），LC3BⅡ及Beclin1蛋白水平增加（P＜0.05）。

圖3 IL-17、LC3BⅡ及Beclin1在各組大鼠結腸組織中的表達Fig.3 Expression of IL-17，LC3BⅡand Beclin1 in colin tissues of rats in each group

表5 Western blot檢測結腸組織IL-17、LC3BⅡ及Beclin1的相對表達水平（±s，n=10）Tab.5 Relative expression levels of IL-17，LC3BⅡand Beclin1 in colon tissues were detected by Western blot（±s，n=10）

表5 Western blot檢測結腸組織IL-17、LC3BⅡ及Beclin1的相對表達水平（±s，n=10）Tab.5 Relative expression levels of IL-17，LC3BⅡand Beclin1 in colon tissues were detected by Western blot（±s，n=10）

Note：Compared with control group，1）P＜0.05，2）P＜0.01；compared with DSS group，3）P＜0.05，4）P＜0.01.

Beclin1/β-actin 0.347±0.0444）0.239±0.0302）0.321±0.0402）3）0.469±0.0591）4）Groups Control DSS DSS+Paeoniflorin DSS+Sulfasalazine IL-17/β-actin 0.869±0.0354）1.247±0.0182）0.974±0.0231）4）0.841±0.0314）LC3Ⅱ/β-actin 1.050±0.0344）0.742±0.0262）0.878±0.0422）3）0.917±0.0211）4）

3 討論

目前，關于UC的病因與發病機制，研究普遍認為環境因素（傳染病、藥物、飲食、壓力等）作用于遺傳易感者，在腸道菌群的參與下，腸道先天免疫異常導致適應性免疫紊亂（Th1/Th2調節失衡和Th17/Treg轉化失衡），炎性因子分泌，反向增加先天免疫損傷，形成惡性循環，最終導致炎癥的發生［2］。IL-17家族通常被認為是連接先天免疫和適應性免疫的橋梁［12］，其與受體結合后，可激活絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKs）以及核轉錄因子κB（nuclear factorκB，NF-κB）等信號通路刺激內皮細胞產生IL-6、IL-8、TNF-α、粒細胞-巨噬細胞刺激因子（granulocyte-macrophage colonystimulating factor，GM-CSF）、細胞間黏附分子-1（in?tercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1）等細胞因子和CXCL-1、CXCL-6及CXCL-8等趨化因子，進而導致單核細胞、中性粒細胞募集及炎癥的產生［13-14］。

DSS是一種人工合成的硫酸鹽多糖，動物經多個循環自由飲用可誘發以血便、黏膜潰瘍、炎細胞浸潤為主要病理改變的慢性潰瘍性結腸炎，其作用機制可能與腸道菌群失調、腸道上皮細胞增殖受抑制、破壞腸道黏膜屏障、巨噬細胞功能障礙等有關，其與人類UC病理改變接近［10］。本研究結果顯示芍藥苷治療后，DSS誘導產生的炎癥因子IL-17、TNFα、ICAM的含量及IL-17蛋白表達降低，表明芍藥苷能夠緩解DSS對腸道的炎癥反應。

有報道顯示，在肺上皮細胞中IL-17A通過激活GSK-3β通路抑制自噬，給予IL-17A阻斷劑則可激活自噬而減輕小鼠肺纖維化［15］。在人HaCaT細胞中，IL-17A同樣可以下調LC3Ⅱ的表達，其機制可能與上調自噬負性調節因子mTOR信號通路有關。然而，IL-17與自噬在UC中的關系鮮有報道。LC3/Atg8是較為廣泛應用于檢測自噬體的標志分子，LC3Ⅱ水平或LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值可反映細胞自噬的活性［16］。Beclin1/Atg6是ClassⅢPI3K復合物的組成部分，涉及自噬體的形成［17］。本研究Western blot結果可見，潰瘍性結腸炎大鼠結腸組織中LC3BⅡ及Beclin1蛋白水平顯著低于空白對照組，結合已有研究報道顯示自噬缺陷可能在炎癥性腸病中起重要作用［18-19］。芍藥苷治療后，LC3BⅡ及Beclin1蛋白水平增加，提示芍藥苷可能通過上調自噬水平減輕DSS對大鼠腸道的損傷。

本研究僅對IL-17及自噬相關蛋白LC3B、Be?clin1在DSS誘導的UC大鼠模型中的表達情況進行了觀察，而在UC中IL-17通過何種信號通路調節自噬以及自噬在UC發病機制中的作用將是今后工作的重點。