非小細胞肺癌組織中長鏈非編碼RNA-THOR的表達意義及生物學作用

鄭穎穎

肺癌是最常見的死亡率最高的癌癥之一。根據國際癌癥研究機構(International Agency for Research on cancer)編制的《GLOBOCAN 2018年癌癥發病率和死亡率估算》報告，2018年1810萬新的癌癥病例(1700萬不包括非黑色素瘤皮膚癌)和960萬癌癥死亡(950萬不包括非黑色素瘤皮膚癌)中，肺癌是最常見的診斷癌癥，占總病例的11.6%，占總癌癥死亡的18.4%，是癌癥死亡的主要原因[1]。肺癌根據組織類型分為小細胞肺癌(small cell lung cancer，SCLC)和非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)，其中NSCLC約占85%以上[2]，由于目前針對NSCLC尚未建立有效的治療措施，死亡率有逐年增高的趨勢[3]。因此，尋找NSCLC發生、發展或與其病理特征相關的特異性靶位點，提出針對性的治療方式，對提高NSCLC患者生存率具有重要意義。

長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，LncRNA)是一類無蛋白質編碼能力，長度大于200nt的與腫瘤發生有密切關系的RNA分子[4-8]。如LncRNA AFAP1-AS1在NSCLC組織中的表達量高于癌旁組織，推斷LncRNA AFAP1-AS1可能與NSCLC的發生發展有關[9]；研究發現，LncRNA BCYRN1在胃癌中的高表達，有促進細胞增殖、遷移，增強細胞耐缺血清環境的能力[10]；結直腸癌中LncRNA SHNG5能介導腫瘤細胞凋亡[11]等。這些研究結果表明，不同腫瘤相關LncRNA有望成為腫瘤治療新靶標。

睪丸相關高度保守的致癌長鏈非編碼RNA(testis-associated highly-conserved oncogenic long non-coding RNA，THOR)是Hosono等人2015年新定義的一類lncRNA，其正常組織表達幾乎僅限于睪丸，但在多種癌細胞中廣泛表達[12]，包括鼻咽癌、腎細胞癌、骨肉瘤、黑色素瘤和舌鱗狀細胞癌等。目前發現其可與胰島素樣生長因子2mRNA結合蛋白1(insulin-link growth factor 2 mRNA-binding protein1，IGF2BP1)具有保守的相互作用，促進腫瘤的發生發展。此外，Hosono等人還證實了，THOR在腺癌(lung adenocarcinoma，LUAD)和鱗癌(lung squamous carcinoma，LUSC)細胞中有表達的現象。目前針對臨床樣本癌組織及癌旁正常組織中THOR的表達研究相對較少，關于THOR與患者臨床病理特征及預后的關系亦鮮見報道。因此，本文采用我國臨床非小細胞癌樣本，通過實時熒光定量PCR的方法檢測，比較非小細胞癌患者癌組織與癌旁正常組織中THOR的表達差異，根據患者臨床病理特征等研究THOR對預后的影響；并通過沉默A549細胞THOR的表達，檢測其對細胞增殖與凋亡的影響；從而探索THOR成為非小細胞肺癌診療的標記分子。

資料與方法

一、研究對象

1 一般資料

選擇2014年6月至2016年12月在我院接收治療的79例NSCLC患者為研究對象。其中男46例，女33例；年齡在35～73(58.43±10.23)之間；有吸煙史者42例，不吸煙者37例；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期32例，Ⅲ～Ⅳ期47例；組織學類型：腺癌35例，鱗狀細胞癌41例，大細胞癌3例；分化程度：高、中、低分化數量分別為39、22、18例。本次研究癌旁正常組織取自腫瘤邊緣5cm以上的位置。并將術后收集的樣本離體后立即轉入凍存管中液氮中速凍，隨后放入-80℃冰箱中保存備用。

2 納入與排除標準

納入標準：(1)經組織病理學診斷后確認為NSCLC的患者；(2)患者在手術前未經放療、化療或其他抗癌治療，未服用過靶向藥物；(3)臨床資料完整；(4)隨訪時間≥6個月。排除標準：(1)患者不僅僅具有單一病癥(NSCLC)，如合并其他惡性腫瘤或嚴重感染性疾病；(2)術前服用過靶向藥物制劑；(3)術前接受過放療、化療或其他抗癌治療。本次研究的全部NSCLC病例患者及其家屬均已了解本研究內容，并簽署了知情同意書。本研究經過醫院倫理委員會批準。

3 隨訪

所有患者采用電話或定期來院復診的方式得到隨訪，隨訪截止日期為2018年12月31日或患者死亡。

二、材料

NSCLC細胞系A549由我院中心實驗室保存；SiRNA-THOR及對照siRNA-NC均由廣州銳博生物科技公司提供；TRIZOL、脂質體 2000購自美國 Invitrogen 公司；總RNA提取試劑盒，Titanium? One-Step RT-PCR Kit 購自湖南艾科瑞生物技術有限公司；鼠抗人 cyclin D1、兔抗人Bcl-2、鼠抗人 Bax 、鼠抗人 cleaved-caspase3、鼠抗人β-actin 抗體、HRP標記二抗購自美國 Santa Cruz Biotech 公司；BCA 蛋白濃度測定試劑盒購自南京凱基公司；ECL 化學發光試劑盒購自美國 Pierce 公司；MTT細胞增殖檢測試劑盒購自碧云天生物技術研究所。

三、方法

1 核酸提取

采用總RNA提取試劑盒進行NSCLC癌組織及癌旁正常組織中的總RNA的提取，具體操作步驟參見說明書。RNA存入-80 ℃冰箱備用。

2 qRT-PCR檢測

以上述提取的樣本總RNA為模板，采用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)方法，對NSCLC癌組織及癌旁正常組織中THOR的表達量進行檢測。本研究采用的是Titanium?One-Step RT-PCR Kit一步法實時熒光檢測試劑盒，THOR的表達量用ΔΔCt法計算，以管家基因GAPDH的mRNA水平作為內參。具體引物序列如下：GAPDH：(Forward)5′-CATGAGCAGTAA ACAGCCATGAT-3′；(Reverse)5′-AGTACAC CCATCG AATTCCAGT-3′[13]；THOR：(Forward)5′-CAAGGTGCTTCTCTCT GGATTT-3′；(Reverse)：5′-GCCAAAGTCATTTGTTGGGTAT-3′[12]。

3 細胞增殖能力檢測

將5000個細胞接種到96孔板中，按照實驗需求培養不同天數后收集細胞，按照MTT細胞毒性/增殖活性檢測試劑盒說明書操作，用酶標儀在490nm處讀取吸光度(A值)，并繪制生長曲線。

4 蛋白質印跡法檢測蛋白表達

收集細胞，加入400ul NP-40裂解液置于冰上，用移液器將其吹散至單細胞懸液，然后繼續置于冰上靜置5 min。開啟低溫冷凍離心機，12 000 rpm，4 ℃，離心10 min，分離上清為所得的蛋白質抽提物。BCA試劑盒檢測蛋白濃度后，取20 μg蛋白制備成20 μl上樣緩沖液，經電泳、轉膜、抗體孵育后，ECL顯影檢測蛋白表達。依次分別使用兔抗人cyclin D1、Bcl2、BAX、cleaved-caspase-3和 β-actin 多克隆抗體作為一抗(抗體稀釋比均為1 ∶10 000)，HRP標記羊抗兔IgG為二抗(抗體稀釋比均為1 ∶20 000)。實驗獨立重復三次。

四、統計學分析

結 果

一、NSCLC癌組織及癌旁正常組織中THOR的表達

通過qRT-PCR檢測79例NSCLC癌組織及癌旁正常組織中THOR的表達水平，結果顯示癌組織中THOR的相對表達量為(0.79±0.31)顯著高于癌旁組織的(0.08±0.5)，差異有統計學意義(t=20.36,P<0.05)。且研究中發現癌組織中的THOR水平均高于其對應的癌旁正常組織(見圖1)。

圖1 非小細胞肺癌(NSCLC)患者癌組織和癌旁正常組織中THOR的表達水平

二、NSCLC患者癌組織中THOR表達水平與臨床病理參數的關系

分析結果顯示NSCLC癌組織中THOR的表達水平與患者性別、年齡、吸煙史、病理類型無關(P>0.05)；但與TNM分期、分化程度和腫瘤大小有關(見表1)。

表1 NSCLC患者癌組織中THOR表達水平與臨床病理參數的關系

三、THOR表達對NSCLC患者預后的影響

根據THOR表達的平均值，將79例NSCLC患者分為高表達組和低表達組。NSCLC癌組織中THOR高表達的患者其生存率顯著低于THOR低表達的患者，差異具有統計學意義(χ2=21.73，P<0.001)(見圖2)。

圖2 THOR 表達水平不同與NSCLC患者生存率的關系

四、沉默THOR表達抑制A549細胞增殖

A549細胞分別瞬時轉染siRNA-THOR及對照siRNA-NC，MTT法檢測細胞增殖。得到如(圖3)所示，轉染siRNA-THOR細胞增殖能力顯著低于siRNA-NC，24h(0.54±0.04 VS 0.63±0.04)、48h(0.65±0.04 VS 0.79±0.05)，差異均具有統計學意義(P<0.001)。

圖3 THOR表達沉默抑制A549細胞增殖

五、沉默THOR表達誘導A549細胞凋亡

細胞周期蛋白在調控細胞增殖中發揮重要作用。cyclin D1 已被公認為是一種原癌基因，其過度表達可致細胞增殖失控而惡性化。本研究通過Western blot法檢測THOR表達沉默后對cyclin D1表達及凋亡相關蛋白Bcl2、BAX 和cleaved-caspase-3的表達的影響。得到如(圖4)所示結果：A549細胞轉染siRNA-THOR后，cyclin D1、Bcl2蛋白表達降低，BAX 和cleaved-caspase-3蛋白表達升高；與siRNA-NC相比，差異均有統計學意義(P<0.001)。提示THOR可能通過調控cyclin D1的表達發揮生物學作用。

圖4 THOR表達沉默對A549細胞cyclin D1、Bcl2、BAX 和cleaved-caspase-3的表達的影響

討 論

肺癌是全世界癌癥相關死亡的主要原因，因此尋找新的診斷和治療靶位點有可能改善患者治療的臨床策略和預后[14]。近年來，越來越多的研究發現，不同lncRNAs在人類癌癥中與正常組織相比,或低、或高的表達，抑制或促進不同類型的腫瘤的發生和發展[15]。因此，腫瘤相關lncRNAs的鑒定、功能分析與臨床病理特征的關系，甚至對預后的影響的研究，對于新的治療靶點可能具有重要意義[16]。

THOR 是Hosono等人采用大規模轉錄組測序方法進行腫瘤相關lncRNAs的研究時發現的一種新的lncRNA，隨后越來越多的研究證明THOR在癌組織中過表達,可促進癌癥的發展。如Cheng等發現THOR可通過靶向β-catenin信號轉導促進肝細胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)細胞去分化和肝腫瘤干細胞(cancer stem cells，CSCs)擴張[17]；Hu Song 證實THOR可以通過與SOX9 3′UTR直接結合來增強胃癌細胞的干細胞等。目前針對THOR在肺癌和癌組織中表達差異性、與臨床病理特征的關系及患者預后方面的影響卻鮮見報道。

為了探明THOR表達和NSCLC之間的關系，提供NSCLC患者治療的指導意見和建議，本研究采用79例臨床NSCLC病理的癌組織和癌旁組織中THOR的表達量進行比較，發現NSCLC組織中THOR的表達量顯著上調。并通過對比不同臨床病理特征的NSCLC患者THOR表達水平，發現THOR表達量與分析結果顯示NSCLC癌組織中THOR的表達水平與TNM分期、分化程度和腫瘤大小有關，但與性別、年齡、吸煙史、病理類型無關。且經過36個月的隨訪調查，通過生存率曲線可以看出NSCLC癌組織中THOR高表達的患者其生存率顯著低于THOR低表達的患者。

研究顯示THOR在人腎細胞癌(RCC)組織和細胞中高表達，并有效促進癌細胞增殖[18]。本研究中我們發現人肺癌細胞A549中THOR高表達，使用siRNA沉默其表達后，CCK-8法檢測得到其增殖被顯著抑制。同時我們檢測細胞周期蛋白cyclin D1的表達變化，觀察到其表達降低。cyclin D1是一個促癌基因，在癌細胞高表達，靶向抑制cyclin D1可以有效抑制細胞增殖，降低抗凋亡蛋白Bcl2，BAX 表達升高，誘導細胞凋亡[19]。沉默LncRNA THOR表達后，有效下調cyclin D1的表達，抑制細胞增殖[20]。本研究中我們發現，沉默肺癌A549細胞LncRNA THOR表達后，cyclin D1、抗凋亡蛋白Bcl2表達降低，凋亡蛋白BAX 和cleaved-caspase-3表達升高。由此我們推斷LncRNA THOR可能通過調控cyclin D1表達促進腫瘤細胞增殖，拮抗細胞凋亡，促進肺癌的發生與發展。

綜上所述，THOR的表達上調在促進NSCLC發展中發揮重要作用；THOR可以作為NSCLC的診斷標志物或預后評估的標志物，但需要大樣本的進一步證實。LncRNA THOR促進NSCLC細胞增殖及其調控cyclin D1表達的分子機制有待進一步實驗探索。