濃縮血小板的制備和保存過程中血小板表面組織因子的表達

何博 譚愛玲 胡文娟 陳小光 黃小敏 陳漢妹 黃小琴

1廣州血液中心（廣州510095）；2廣州市醫學重點實驗室（血液安全重點實驗室）（廣州510095）

血小板數量減少或者功能異常患者需要輸注大量血小板以預防或阻止出血［1］。這些以高濃縮血小板懸浮液的形式提供的血小板即血小板濃縮物（platelet concentrate，PC）［2］。PC輸注成功的關鍵是血小板具有良好的止血潛力。而血小板減少癥病患需要輸注大量血小板以預防或阻止出血［3］。特別是輸注PC治療病患時，必須高效、及時的止血［4］。

由于多種原因，評估PC療效并不容易。輸注適應癥存在異質性，病患從意外創傷到大手術再到血液腫瘤和遺傳性或獲得性血小板疾病等包括多種類型。對于每種適應癥，均難以實現患者群體一致性，并且所有患者并非都出現（嚴重）出血。此外，缺乏標化的指標客觀測量血小板在輸血功效中的作用。既往PC活力等檢測只反映濃縮方法的效率而并非血小板質量。組織因子（tissue factor，TF）是凝血級聯反應的啟動子，與血Ⅶ/Ⅶa結合形成復合物后，啟動外源性凝血途徑，并與血小板互作，形成纖維蛋白［5］。二者共同參與止凝血反應過程，并扮演重要角色。前期研究表明血小板表面存在TF［5］。此外，在實驗條件控制良好的情況下，血小板顆粒和小管系統中含有活化的TF。然而，這種TF是血小板來源的，還是通過微粒介導的轉移機制從白細胞中獲得的，仍存在爭議。并且目前未見評估獻血員全血和輸血用PC表面TF表達的研究［6］。流式細胞術是研究血小板表面組織因子表達模式的有力工具，能夠反映血小板活化引起的變化。因此，本研究旨在探討PC的制備和保存過程中血小板表面TF的表達變化以及變化程度，并預測該蛋白是否可以作為血小板止血潛力的指標。為了校準分析，使用多個血小板激活標記物，如P?選擇素（CD62P）［7］、纖維蛋白原［8］和GPIIb（CD41）［9］。本研究還在病患基線資料基礎上分析了獻血員ABO血型對TF和其他止血標志物表達的影響。

1 材料與方法

1.1 血液采集和樣品制備收集自我中心的189名獻血員，男156例，女24例，包括O組（O型血）68例，A組（A型血）64例，B組（B型血）48例，AB組（AB型血）9例，全血共（452±53）mL置于CPD采血五聯袋。獻血員平均年齡（42.8±22.1）歲，血小板計數為（229.7±45.5）×109/L。在獻血日（第0天），從每個血袋中取500 μL用于流式細胞術分析血小板表面抗原表達。

1.2 PC制備從采血（第1天）起24 h內，在我中心制備PC。采集后6 h內分別對以上三組五聯袋采集的全血第一次離心（2 100 g×12 min）；溫度（22±2）℃，分出白膜層血小板，靜置30 min后，再次離心（400 g×8 min），將血小板轉移至血小板袋內，即為濃縮血小板［10］。在（22±2）℃環境下靜置1～2 h，待其自然解聚后，輕輕搖動血袋，使其成均勻混懸液。全自動血細胞分析儀進行血小板計數。在同一天（第1天）和存儲3 d（第4天）或4天（第5天）后進行流式細胞術。

1.3 流式細胞儀分析BD公司FACSCalibur流式細胞儀檢測，CellQuest軟件分析數據。通過常規方法，單抗免疫熒光標記測定平均熒光強度或特異性熒光抗體結合陽性血小板的百分率來檢測血小板的活化情況。將5 μL獻血員全血或PC樣品添加到100 μL PBS中，分別加入飽和濃度的TF?FITC，CD62P?FITC，纖維蛋白原?FITC，CD41?FITC（均采購自Invitrogen流式細胞儀抗體，美國）。使用同型對照IgG?FITC抗體作為陰性對照。所有標記均在流式細胞儀試管中進行（Attune NxT，Invitrogen）。在室溫20 min后，將樣品稀釋于600 μL PBS中，并立即通過流式細胞儀進行分析。對于每個標記，記錄陽性血小板占血小板總數的百分比；數據同時分析為以任意單位表示的平均熒光強度（aver?age fluorescence intensity，MFI），熒光信號強度與抗原密度直接相關。并計算第4天或第5天與第1天的值之間的陽性血小板或MFI的百分比差異。

1.4 統計學方法使用SPSS 22.0統計軟件包進行數據分析，根據檢測變量的分布，采用t檢驗比較計量資料兩組之間的差異。在P<0.05時，差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PC制備對血小板TF的影響見圖1，與獻血員全血（非黑色柱）相比，PC（黑色柱）中的TF和其他標志物的表達明顯高于全血（P<0.05）。其中TF增加48%［血小板陽性率（14.8±5.4）%］，纖維蛋白原增加38.2%［血小板陽性率（23.9±10.2）%］，CD62P增加150%［血小板陽性率（26.5±13）%］和CD41增加10.3%［MFI（9 920±2 761）單位］，說明PC制備可促進TF活化。

圖1 PC（黑色柱）制備對血小板表面上的TF、纖維蛋白原、CD62P和CD41的表達影響Fig.1 Expression of TF，fibrinogen，CD62P，and CD41 on platelet surface in freshly prepared PC（black bars）

2.2 PC儲存對血小板TF的影響在PC儲存期間，從第1天到第5天，TF以及其他血小板標記物的水平持續增加（圖2）。特別是在第5天，TF的陽性血小板百分比（平均升高）增加了32%（相對于第1天，P<0.05），纖連蛋白原的上升了31%（P<0.05），CD62P水平上升了148%，CD41隨時間MFI逐漸上升，說明PC儲存可促進TF活化。

2.3 各組獻血員全血血小板中TF分析見圖3。流式細胞儀分析的全部獻血員及其ABO血型的全血血小板中TF的表達。TF陽性血小板的平均百分數為（10±6.7）%。與A組（9±5.2）%，B組（8.4±5.3）%和AB組（7.9±4.9）%獻血員相比，O組的血液樣本顯示TF陽性的血小板百分比（11.7±4.8）%高于前兩組（均P<0.05）。說明TF存在于各組獻血員血小板表面，且O型血TF表達顯著高于非O型血。

2.4 ABO血型組濃縮后與各指標關系根據ABO血型分析顯示（表1），除TF抗原密度在A組血小板中最低，與其他血型組比較差異有統計學意義（P<0.05）外，其他評估指標差異均無統計學意義。說明除TF外，ABO血型對活化各指標無影響。

圖2 PC儲存對血小板止血指標的影響Fig.2 Effect of PC storage on platelet hemostatic markers

圖3 健康獻血員全血中血小板表面的TF表達Fig.3 TF expression on platelet surface in donor whole blood

3 討論

血小板以高濃縮血小板懸浮液的形式提供，即所謂的PC，通過單采血液從單個獻血員或合并多個隨機獻血員富含血小板的血漿中獲得［11］。由于存在細菌污染風險和所謂的“血小板儲存損傷”現象［12］，一般建議盡快使用PC；在我國，通常是在準備PC后的5 d內使用［13］。關于凝血受體，一些研究表明血小板表面存在TF［14-15］。TF是一種膜糖蛋白，是血漿凝血因子Ⅶ的高親和力受體。TF/FVIIa復合物觸發外在途徑，最終導致凝血酶生成和纖維蛋白形成［16］。此外，在良好控制的實驗條件下，血小板在α顆粒和小管系統中含有功能性活性TF［17-19］。按以上結果表明，獻血員全血血小板存在TF，在PC制備和保存過程中其表達得以保留。

表1 ABO血型各指標關系Tab.1 Relationship among indexes of ABO blood group system±s

表1 ABO血型各指標關系Tab.1 Relationship among indexes of ABO blood group system±s

所有組O組A組B組AB組4.7±5.514.1±6.614.5±3.816.5±7.615.7±6.1 655±223755±269562±116651±166647±187 TF平均百分數（%）MFI纖維蛋白原平均百分數（%）MFI CD62P平均百分數（%）MFI CD41平均百分數（%）MFI 1 23.7±10.4 815±415 26.6±12.8 1 038±425 100 9 923±2758 24.8±11.1 768±308 25.3±11.3 1 025±465 100 9 375±3 275 23.3±8.1 792±471 26.6±15.2 985±355 100 9 668±2 210 22.5±12.5 952±332 26.6±19.3 1 126±355 100 10 875±1 750 23.5±11.3 738±365 25.3±15.6 1 026±386 100 9 785±2 021

PC輸血成功的關鍵是血小板具有良好的止血潛力［20］。特別當給予PC來停止正在進行的出血事件時，血小板止血作用必須是有效且快速的。現在有大量研究支持以下證據［21-23］：血小板不僅通過形成血小板栓塞參與原發止血過程，而且還可以通過提供特定的高親和力受體，蛋白酶，酶原和輔因子來積極促進凝血級聯的傳播，從而有助于將凝血酶的產生定位在血管損傷的部位［24］。不管血小板TF的來源如何，它的存在顯著促進凝血作用。以上均強調PC保持TF表達的重要性，并本研究表明，PC制備和儲存后，血小板表面的TF沒有被去除，TF增加分別為48%、32%。在PC存儲期間TF陽性血小板的百分比增多。P?選擇素是測量血小板活化的經典標志物。本研究數據顯示，在PC制備和儲存過程中，標志物的表達均顯著增加，這與以前的報道是一致的。P?選擇素這被認為是最敏感的血小板活化標記，無論是從全血處理到PC和存儲期間均呈現顯著增加。在PC儲存結束時，與全血相比，P?選擇素陽性血小板的百分比增加了約150%。表明TF可能是另外一個有潛在標志物，并且，TF對于血小板活化的臨床療效，可能更具有直接意義。目前的工作還評估了ABO血型對血小板止血參數的影響，這一領域還在初步探索階段。早期已證明ABO血型對血管性血友病因子（von willebrand factor，vWF）和凝血因子VIII有顯著影響［25］，這兩種標記物的循環水平O組受試者比非O組受試者更低。筆者觀察到，來自O組的血小板對TF的陽性率最高。但在PC制備后，在ABO血型之間的血小板止血標志物的差異消失了。結果顯示血型并不會影響PC制備后止血標記物的表達。

本研究的局限性歸納為以下幾點：首先，本研究僅納入180名獻血員。其次，僅利用流式細胞儀評估制備及儲存對于血小板的影響。最后，依然是單中心研究。因此，進一步研究需要經多種類型的血液自動分析儀進行大規模的多中心分析，以驗證本研究結果的可靠性。

總之，以上結果均表明，在PC制備過程中直至儲藏期結束，血小板表面均有TF表達。當然，凝血分子機制極為復雜，研究僅局限在TF表達方面，并且臨床醫生及研究小組的科學能力會影響結果評估。血小板與TF表達之間有密切關系，血小板在止血、凝血及血栓性疾病發病方面起著其他重要的作用，因此在輸血實踐中，將進一步研究對接受受試者的止血平衡產生臨床相關影響。