西藏酵母對玉米赤霉烯酮的清除效果及作用機理研究

郭倩倩，周海芳，郝佳容，葉昀愷，曹 陽，劉興泉，胡 浩

（1.浙江農林大學 農業與食品科學學院，浙江 杭州 311300；2.國家糧食和物資儲備局科學研究院，北京 100037）

玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEN）是一種非類固醇霉菌毒素，廣泛存在于玉米、小麥、大麥等谷物及其加工副產物中[1]。該毒素主要由鐮刀菌屬（Fusariumsp.）真菌通過聚酮類合成代謝途徑產生，具有生殖和發育毒性，細胞和遺傳毒性，對腫瘤細胞生長具有促進作用，可導致生殖器官發生癌變[2]。因此迫切需要相關手段對 ZEN進行清除、脫毒，從而保證谷物及其加工產物的安全性，對我國的糧食安全具有十分重要的意義。

清除ZEN主要通過化學、物理、生物三種方法[3]。物理化學清除法能耗高、易造成營養損失，甚至造成二次污染[4]。生物清除法不易造成糧食的營養成分流失，且具有專一性強、轉化率高、環境污染小等特點，已成為真菌毒素清除的研究熱點。相關研究發現一株枯草芽孢桿菌在48 h內對初始濃度為10 mg/L的ZEN降解率為99.7%[5]；一株解淀粉芽孢桿菌NS2對5 mg/L的ZEN標準品的降解率為96.0%[6]；11株對ZEN有降解能力的芽孢桿菌，72 h后其降解率在58%～96.9%[7]。上述研究表明，生物法對ZEN具有較好清除效果，但該法易受環境因素影響，穩定性較差。

目前，用于ZEN生物降解的微生物主要為細菌、真菌、霉菌[8]。其中，根霉菌和酵母菌等可將 ZEN降解為低毒的 β-玉米赤霉烯醇或其他無毒產物。特別是酵母菌，降解效果好，其本身大多對人畜無致病性危害[9-10]，同時對多種脅迫、逆境具有較強耐受力、對營養要求低。西藏地區微生物不僅種類豐富，而且受高海拔、強紫外線、低溫、低氧等環境因素影響，具有更好的功能特性和環境脅迫耐受能力。因此利用西藏地區菌種資源進行糧食毒素清除研究更具應用和開發價值，且可克服生物清除效果穩定性差的難題。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗酵母均由西藏大學提供，其中膠紅酵母（Rhodotorulamucilaginosa）為已鑒定保藏菌種（編號CGMCC10223），NYDA培養基4 ℃冰箱保存；甲醇（色譜級）、乙醇（色譜級）：Fisher科學世界公司；ZEN毒素標準品：北京百奧萊博公司；牛肉膏、無水葡萄糖、酵母粉、瓊脂粉：北京奧博星生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

Agilent 1100液相色譜儀：美國安捷倫公司；島津 8060NX液質聯用色譜儀：日本島津公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 HPLC-FLD檢測條件

激發波長274 nm，發射波長440 nm；流動相V（甲醇）∶V（水）=80∶20；流速1.5 mL/min；柱溫30 ℃；進樣量10 μL。

1.3.2 液質聯用檢測條件

色譜檢測條件：液相系統流速：0.7 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：20.0 μL；熒光檢測器，檢測波長：274 nm，發射波長：440 nm；流動相：流動相A為0.1%甲酸水溶液，流動相B為色譜級甲醇。

質譜檢測條件：電噴霧離子源（ESI）；檢測方式為多反應監測模式（MRM）；離子源溫度：350 ℃；干燥氣流速度：9.0 L/min；霧化氣壓力：30 psi；毛細管電壓：3.5 kV；碎裂電壓：0.1 kV；碰撞電壓：40 eV；檢測駐留時間：100 s。

1.3.3 酵母培養

1.3.3.1 培養基 NYDA培養基：牛肉膏8 g，無水葡萄糖10 g，酵母粉5 g，瓊脂粉20 g，蒸餾水1 000 mL；NYDB培養基：牛肉膏8 g，無水葡萄糖10 g，酵母粉5 g，蒸餾水1 000 mL。培養基配置好后，高壓蒸汽滅菌（121 ℃，15 min）。

1.3.3.2 酵母菌活化 用無菌接種環挑取一環保存在4 ℃冰箱中的酵母接種于NYDA培養基中，在28 ℃下恒溫培養48 h。

1.3.3.3 液體培養 挑取一環經活化后的酵母接種于裝有50 mL NYDB培養基的錐形瓶中，然后將上述培養液在 150 r/min，28 ℃下進行搖床培養24 h。

1.3.3.4 調整濃度 將液體培養24 h后的酵母菌液，在4 ℃、5 000×g轉速下，離心10 min，除去上層清液，無菌水洗滌兩次后，再用無菌水重新懸浮。懸浮后的酵母細胞用無菌水進行梯度稀釋并用血球計數板計數，選擇試驗所需濃度加入培養基。

1.3.4 清除ZEN的酵母菌株的篩選

在裝有50 mL NYDB培養基的錐形瓶中，加入1 mL濃度為1×108cells/mL的酵母菌懸液，再加入適量 ZEN儲備液，控制 ZEN初始濃度為5 μg/mL，在搖床轉速150 r/min，28 ℃條件下培養24 h，分別在0 h和24 h取樣。對照組加入1 mL無菌水，設置三組平行。取樣品500 μL于1.5 mL離心管中，加入500 μL乙醇（HPLC級），渦旋震蕩均勻后，靜置30 min，用0.22 μm濾膜過濾后置于–20 ℃冰箱中保存待測。

1.3.5 酵母對ZEN的清除效果研究

1.3.5.1 酵母對不同濃度ZEN的清除效果 酵母培養方法同 1.3.3，ZEN 終濃度分別為 5、10、15 μg/mL，在搖床轉速150 r/min，28 ℃條件下培養24 h，分別在0 h和24 h取樣。對照組加入1 mL無菌水，設置三組平行。取樣品500 μL于1.5 mL離心管中，加入500 μL乙醇（HPLC級），渦旋震蕩均勻后，靜置30 min，用0.22 μm濾膜過濾后置于–20 ℃冰箱中保存待測。

1.3.5.2 不同菌種濃度對 ZEN清除效果的影響在裝有50 mL NYDB培養基的錐形瓶中，加入1 mL濃度分別為 1×106、1×107、1×108、1×109cells/mL的酵母菌液的酵母菌懸液，再加入適量ZEN儲備液，控制ZEN初始濃度為5 μg/mL，在搖床轉速150 r/min，28 ℃條件下培養24 h，分別在0 h和24 h取樣。對照組加入1 mL無菌水，設置三組平行。取樣品500 μL于1.5 mL離心管中，加入500 μL乙醇（HPLC級），渦旋震蕩均勻后，靜置30 min，用0.22 μm濾膜過濾后置于–20 ℃冰箱中保存待測。

1.3.6 酵母清除ZEN的主要途徑研究

將活化培養得到的酵母細胞濁液分成三組進行不同處理。活酵母細胞：用無菌水重新懸浮，并用血球計數板計數將濃度調整為1×108cells/mL；熱殺死酵母細胞：將酵母菌懸液置于100 ℃水浴中加熱30 min殺死酵母，用血球計數板計數將濃度調整為1×108cells/mL；酵母上清液：將活化、培養后的酵母液，在4 ℃，5 000 r/min下離心10 min，取上清液用經滅菌的0.22 μm濾膜過濾，得到無細胞濾液。加入適量ZEN儲備液，控制ZEN初始濃度分別為5 μg/mL，然后分別在50 mL NYDB培養基的錐形瓶中分別加入濃度為 1×108cells/mL的活酵母細胞和熱殺死酵母細胞懸浮液1 mL，在搖床轉速150 r/min，溫度28 ℃下培養48 h，分別在 0、6、12、18、24、30、36、48 h取樣。對照組加入1 mL無菌水，設置三組平行。將樣品在4 ℃，5 000 r/min下離心10 min后，經0.22 μm濾膜過濾，取上清液500 μL于1.5 mL離心管中，加入500 μL乙醇（HPLC級），渦旋震蕩均勻后，靜置30 min使其充分浸提，置于–20 ℃冰箱中保存待測。

1.3.7 酵母ZEN降解作用的測定

酵母培養方法同1.2.3。對照組加入1 mL無菌水，處理組加入終濃度為5 μg/mL的ZEN，每個處理設置三組平行。每組樣品取500 μL于1.5 mL離心管中，加入500 μL乙醇（HPLC級），渦旋震蕩均勻后，靜置30 min，用0.22 μm濾膜過濾后利用LC-MS進行產物測定。

1.3.8 脅迫耐受能力測定

1.3.8.1 氧化脅迫 制備濃度為 1×108cells/mL的酵母懸浮液，分別加入過氧化氫，制備過氧化氫終濃度為10、20和50 mmol/L的10 mL酵母懸浮液。將配制好的懸浮液在28 ℃，200 r/min下放置 40 min后，稀釋后，各取 100 μL涂布于NYDA平板，同體積未經過氧化氫處理的酵母懸浮液為對照，實驗室釀酒酵母做對比。平板28 ℃培養 2天后統計菌落數。3個平行處理，試驗重復2次。

1.3.8.2 低溫脅迫 低溫脅迫采用快速冷凍方法進行。將培養好的西藏膠紅酵母用0.05 mol/L PBS緩沖液（pH 7）配制成濃度為1×108cells/mL的細胞懸浮液，取1 mL置于1.5 mL離心管中，在–80 ℃下快速冷凍30 min后取出，常溫水浴（25 ℃）孵育20 min，梯度稀釋后取100 μL涂布于NYDA平板，28 ℃下培養48 h后統計低溫處理前后菌落總數，同樣處理的實驗室釀酒酵母為對照。3個平行處理，試驗重復2次。

1.4 數據分析

試驗每組處理設置3次平行，結果以均值±SD表示。采用SPSS 25.0軟件進行單因素方差分析，P＜0.05表示差異顯著。利用GraphPad Prism 8軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 篩選降解ZEN的酵母

以西藏大學提供的西藏地區 10株酵母為研究對象，研究其在實驗條件下對 ZEN的清除效果，如表1所示，經24 h培養后，西藏膠紅酵母對ZEN具有較好的清除效果，對ZEN的清除率達到90%以上，其余菌種對ZEN的清除效果則較為有限，因此，本試驗選取西藏膠紅酵母開展進一步研究。

表1 不同酵母對ZEN的清除率Table 1 The elimination rate of ZEN by different yeasts

2.2 膠紅酵母對ZEN的清除效果研究

膠紅酵母對不同濃度ZEN清除效果的影響結果見表2所示，當ZEN初始濃度為5 μg/mL時，經24 h培養后，西藏膠紅酵母將 ZEN清除至0.19 μg/mL。當ZEN初始濃度為10 μg/mL和15 μg/mL時，該酵母將ZEN清除至1.14 μg/mL和1.49 μg/mL。由此可見，隨著ZEN初始濃度的增加，膠紅酵母對ZEN的清除效果會有所降低，但其清除率仍可達80%以上。上述結果表明該酵母對ZEN的清除作用相對較為穩定。不同濃度膠紅酵母懸浮液對ZEN的清除效果研究表明該酵母在低濃度時即可有效清除ZEN（見表3），隨著濃度的增加，其清除效果具有一定的提升。

表2 膠紅酵母對不同濃度ZEN清除效果的影響Table 2 Effect of R.mucilaginosa on the removal effect of ZEN at different concentrations

表3 不同濃度膠紅酵母對ZEN的清除效果Table 3 The removal effect of different concentrations of R.mucilaginosa on ZEN

2.3 膠紅酵母清除ZEN的作用途徑研究

試驗通過評價不同膠紅酵母處理液對ZEN的清除效果來確定其主要作用途徑。如圖1所示，與對照組相比，經過滅活處理的酵母熱殺死液可以顯著降低培養基中ZEN含量。其中，前6 h對ZEN的清除效果與活酵母組基本相同，可使ZEN含量迅速降低，而活酵母組中ZEN含量隨著時間的延長繼續降低，24 h時ZEN含量基本為0。酵母熱殺死液18 h后對ZEN的清除效果略遜于活酵母，30 h時無ZEN檢出，而酵母上清液對ZEN的清除效果較為有限。

圖1 膠紅酵母不同處理液對ZEN的清除作用Fig.1 The removal effect of different treatments of R.mucilaginosa on ZEN

試驗結果表明，膠紅酵母對ZEN清除主要通過吸附作用進行，酵母活細胞由于酵母活性較好，細胞數不斷增多，對培養基中ZEN可持續吸附；而酵母熱殺死液在細胞滅活時，可能由于部分細胞的葡聚糖結構發生變化，葡聚糖能夠通過糖苷鍵與毒素產生吸附作用[11]。

2.4 膠紅酵母對ZEN降解作用研究

為進一步確定膠紅酵母是否在胞內對ZEN具有降解作用，試驗提取了酵母胞內的ZEN，并利用LC-MS進行了鑒定。通過比較圖2～4可知，西藏膠紅酵母吸附 ZEN后具有一定的降解作用，ZEN的降解產物相對分子質量為320，可能是玉米赤霉烯醇或玉米赤霉酮。但其具體降解產物的化學結構進一步的確認。

圖2 西藏膠紅酵母對玉米赤霉烯酮的降解產物LC-MS檢測色譜圖Fig.2 LC-MS detection chromatogram of the degradation product of zearalenone by Tibet R.mucilaginosa

圖3 玉米赤霉烯酮LC/MC檢測質譜圖Fig.3 LC/MC detection mass spectrum of zearalenone

圖4 玉米赤霉烯醇、玉米赤霉酮LC-MS檢測質譜圖Fig.4 LC-MS detection mass spectrum of zearalenol and zearalenone

2.5 膠紅酵母脅迫耐受能力研究

西藏膠紅酵母對脅迫的耐受特性是其影響生物清除法穩定性的關鍵。如表4所示，西藏膠紅酵母與實驗室普通釀酒酵母XZ-9和XZ-10相比，在10和20 mmol/L的低濃度氧化脅迫條件下具有較好的脅迫耐受能力；同時，經–80 ℃下快速低溫脅迫后，膠紅酵母的活菌菌落數顯著高于XZ9和 XZ10（P＜0.05）。上述結果表明，西藏膠紅酵母具有較好的環境脅迫耐受能力，降低細胞損傷和凋亡的速率，提高酵母胞內物質活性對ZEN的吸附作用，具有較好的清除效果。

表4 膠紅酵母對氧化脅迫的耐受能力Table 4 The tolerance of R.mucilaginosa to oxidative stress

圖5 膠紅酵母對低溫脅迫的耐受能力Fig.5 The tolerance of R.mucilaginosa to low temperature stress

3 結論

通過研究西藏酵母對玉米赤霉烯酮的清除效果，發現西藏膠紅酵母對ZEN具有較好的清除能力，具體作用規律如下：（1）西藏膠紅酵母對ZEN的清除機制主要為吸附作用，同時該酵母在吸附ZEN后存在一定的胞內降解作用；（2）西藏膠紅酵母與實驗室普通酵母相比，對氧化脅迫和低溫脅迫具有較好的耐受能力，可作為克服真菌毒素生物清除缺陷的潛在菌種。

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