面向創新人才培養的生物技術制藥實驗教學改革

趙 慧，高永峰，倪春林，周武藝

（華南農業大學材料與能源學院生物化工與制藥實驗教學示范中心，廣州 510642）

0 引言

近20 年來，現代生物技術發展迅猛，60%以上生物技術成果應用于制藥工業，生物技術產業隨之崛起，傳統醫藥得到改良，特色新藥得以開發［1］，同時對生物技術人才的需求量也逐年增加。為此，很多高等院校設置了與生物藥物研究、生產相關的專業，如生物技術、生物工程和制藥工程等專業［2］。發展是第一要務，人才是第一資源，創新是第一動力。高等教育的首要目標就是要為社會發展培養創新型和綜合應用型人才，而同時人才的塑造是離不開高等院校對學生創新精神的培養和為學生提供的創新創業服務平臺［3］。2018 年教育部《關于加快建設高水平本科教育全面提高人才培養能力的意見》（教高〔2018〕2 號）提出了加強校內實驗教學資源建設等要求［4］。該文件不僅強調了高校綜合性實驗平臺建設的重要性，更是強調了綜合性實驗平臺對未來人才的創新精神培養的重要性。綜合性實踐一般以模擬解決生產實際問題為基點，以培養學生多方面能力為目的，如培養學生的文獻綜合能力、創新設計能力、理論和技能的靈活運用能力以及團隊合作能力等［3，5-6］。

生物分離方法因生物分子的多樣性及生物化學的復雜性呈現出豐富和多變的特點，生物分離工藝往往不能用數學模型精確界定，它既是一種技術，也是一門科學，且在工藝開發中常需考慮多項法規要求［7］。在生物制藥產業中，生物分離工藝開發逐漸被視為競爭性優勢的關鍵因素，采用最簡單的方法在不降低生物活性的前提下大量獲得純度較高的生物活性產品是提高企業競爭力的最直接方法。對于大學生而言，具備良好的綜合實驗設計（分離純化設計）能力是提高人才競爭力的重要途徑之一。因此，需要打破傳統的實驗教學格局，改革教學模式，提升實驗課的自由度，關注學生的學習過程，引入多維的學生老師互動等［8］。

雞蛋溶菌酶（lysozyme），即1，4-N-溶菌酶，又稱粘肽N-乙酰基胞壁酰水解酶或胞壁質酶，是一種可水解細菌細胞壁的堿性蛋白酶，具有抗菌、消炎、消腫和增強體內免疫反應等多種藥理作用，可作為殺菌劑廣泛用于食品保鮮、醫學臨床等［9-12］，雞蛋和哺乳動物乳汁是溶菌酶的主要來源。學生以蛋清溶菌酶作為研究對象，進行綜合實驗設計，具有以下幾個優點，①雞蛋來源豐富且廉價；②蛋清中溶菌酶含量高，學生易得到結果，且經過實驗條件優化后，效果明顯，易于學生進行比較分析；③該實驗綜合性強，涉及化學和生物等多個學科；④該實驗強調了學生需要掌握的重要生物技術包括生物藥物的分離純化、生物藥物鑒定的基本原理和方法等，適合生物技術、生物工程和制藥工程等專業的綜合生物技術類實驗項目。

1 實驗方案設計

1.1 材料與儀器

實驗材料：雞蛋，溶酶小球菌，D152 大孔弱酸性陽離子交換樹脂，氯化鈉，硫酸銨，磷酸氫二鈉，鹽酸和氫氧化鈉等；溶菌酶檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所（貨號A050）。

實驗器材：紫外分光光度計，循環水式真空泵，低溫離心機，層析柱，布氏漏斗等。

1.2 溶菌酶的提取

樹脂處理流程：D152 樹脂先用1 mol/L NaOH 攪拌浸泡4～8 h后，再用1 mol/L HCl攪拌浸泡4～8 h，使其全部轉變成氫型，蒸餾水洗樹脂至pH 5.5，保持過夜，此為H+型樹脂；取一部分H+型樹脂再用2 mol/L NaOH處理，使之轉變為Na+型，pH值不小于6.5。氫型和鈉型兩種樹脂按1 ∶1的比例混合備用［13-14］，流程為：

（1）蛋清處理及吸附。取1～2 個新鮮雞蛋清加入等體積去離子水，用1 mol/L HCl 調pH 值至7 左右，過濾收集濾液，按樹脂/體積蛋清比為12.5%加入上述混合型樹脂。

（2）洗滌。用與樹脂等體積的去離子水洗滌15 min，過濾，重復洗3 次，測其O280的吸光度，洗至吸光度低于0.01 即可。

（3）洗脫。將樹脂加入至等體積的10%硫酸銨水溶液中，攪拌洗脫50～60 min。

（4）沉淀及樣品收集。往濾液中緩慢加入硫酸銨使鹽濃度達到32%，放入冰箱靜置過液，收集濾餅，即得溶菌酶，丙酮洗滌，真空干燥約3 h，稱取重量。

1.3 溶菌酶的SDS-PAGE鑒定

采用12%分離膠的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析溶菌酶純度，采用Image J軟件分析蛋白電泳條帶灰度。

1.4 溶菌酶酶活測定

以溶酶小球菌為底物，溶菌酶可水解小球菌細胞壁，小球菌裂解從而細胞濃度下降，透光度伴隨增強，據此原理，可測定提取液中溶菌酶酶量（μg/mL）與酶活（U/mL）。具體方法參見溶菌酶檢測試劑盒［15］。

1.5 學生方案設計

上述步驟為標準方案。學生方案1 采用單一鈉型（Na+）樹脂吸附，洗滌、洗脫和沉淀等方法與標準方案相同。學生方案2 主要以鹽析法提純溶菌酶，方案分為兩部分，①直接采用NaCl鹽析結晶法提取溶菌酶為樣品1［16］；②直接采用飽和度為50%的硫酸銨鹽析沉淀蛋清中溶菌酶為樣品2，剩余清液繼續用80%硫酸銨鹽析得樣品3。學生設計方案3 雖采用混合型樹脂吸附，且樹脂吸附、洗滌、洗脫和沉淀方法同標準方案，但蛋清預處理方案不同于標準方案，先以0.05 mol/L NaCl溶液以1∶2倍體積比稀釋蛋清液，后用1 mol/L乙酸將懸浮液的pH調節至5.0，再以50%乙醇（v/v）連續攪拌6 h沉淀后再進行吸附洗脫等。

2 結果與討論

2.1 溶菌酶的SDS-PAGE鑒定

實驗標準方案結果如圖1（a）所示，溶菌酶提取含量適中，純度較高，方便凝膠過濾層析法進一步純化。學生方案1 提取結果如圖1（b），結果顯示，每一樣品中均含有一定量的溶菌酶，但雜蛋白含量很高，這將大大影響后期的回收率。選取溶菌酶含量較高的幾個樣品做進一步含量分析，對應泳道為圖1（b）3、4 和6。比較標準方案與學生方案1 可知，混合型樹脂吸附特異性較好，可知樹脂離子型式對目的蛋白的提取有較明顯的影響。

學生方案2 提取結果如圖1（c）條帶1～3 所示，由結果可知，直接采用NaCl 鹽析結晶法，并未得到預期結果（見泳道1）。直接采用50%～80%的硫酸銨鹽析，雖能沉淀目的蛋白，但分辨率不高，同時伴隨大量的雜蛋白沉淀（見泳道2、3），這將大大增加進一步純化的成本，影響后期的回收率。就實驗效果而言，學生方案2 與學生方案1 效果相當。

學生方案3 提取結果如圖1（d）所示，每一樣品均顯示目的蛋白含量低，雜蛋白含量高，且雜蛋白種類較學生方案1 和2 更多。該方案雖采用混合型樹脂吸附，但蛋清前期預處理方法不同于標準方案。事實證明，不同預處理方法會使溶菌酶蛋白分子和蛋白清液的離子狀態和離子含量不同，則后續的樹脂吸附等方法也須隨之調整優化。因此，如果學生只一味機械照搬，不加理解，則提取結果必然偏離預期。根據圖1（d），選擇溶菌酶含量較高的樣品做進一步含量分析，對應泳道為圖1（d）2 和5。

圖1 溶菌酶的SDS-PAGE電泳鑒定

根據每組電泳時所用溶菌酶標準品用量、蛋白Marker用量以及各組的上樣量，采用Image J分析電泳中各條帶灰度，初步推算溶菌酶提取濃度，如圖2所示，可更直接顯示各組溶菌酶濃度（均以相同體積折算）。

圖2 SDS-PAGE電泳條帶灰度分析

綜上所述，通過蛋白電泳分析，蛋白提取的效果清晰明了，可直接反映蛋白提取方案的優劣。

2.2 溶菌酶酶量/酶活測定

根據所得溶菌酶樣品的物理特點，采用空白對照法，結合溶菌酶標準品的濃度，通過分光光度計530 nm處測得的透光度值，計算各樣品中具有生物活性溶菌酶的含量（μg/mL），酶活（U/mL）以及溶菌酶的最大理論回收率，結果如表1 和圖3 所示。

表1 各方案提取樣品中溶菌酶的酶量、酶活和最大理論回收率

圖3 所示清晰地展現了各方案溶菌酶提取量與回收率的關系，盡管學生的3 個方案提取的具有生物活性的溶菌酶含量比標準方案略高，但綜合分析純度和回收率關系，學生方案的提取效果均不理想，相反標準方案優于學生方案。

圖3 各方案提取溶菌酶的酶量和回收率

3 實驗教學安排與教學效果

3.1 實驗教學安排

本實驗將學生分成4 人小組若干，以組為單位，每組需獨立設計實驗方案，并完成全部實驗內容包括溶菌酶的提取，鑒定和酶活測定。實驗工作量較大，小組成員需要合作分工，討論確定實驗方案，組長需合理安排每個成員的工作，每個成員需要相互了解彼此的工作內容和進展，便于實驗的銜接和推進。

每組通常需要提前準備，并達到以下目標：①小組成員查閱文獻，討論設計實驗方案，與指導老師討論并確定實驗方案，在獨立查閱文獻的過程中重溫多種生物分離技術的理論要點和技術要點，了解生物分離技術重要性以及研究進展；②掌握生物藥物的生理生化特點，能靈活運用各種分離方法處理目標產物；③準備相關試劑的配制，熟悉實驗過程中需要的重要儀器和重要分離方法，重注細節設計；④各小組成員通過分工合作，在規定時間內開展實驗并達到預期目標；⑤實驗結束后須以組為單位，分享實驗過程的得與失。

3.2 實驗結果表達與要求

通過SDS-PAGE 蛋白電泳分析溶菌酶的提取結果，確定其蛋白分子量，同時學習使用Image J軟件分析條帶灰度，根據蛋白電泳中所用標準品的濃度和條帶灰度的關系，初步推算樣品中溶菌酶的濃度；根據所得樣品的性質選擇合適的溶菌酶酶活測定方法，計算活性溶菌酶含量、酶活以及根據總蛋白量計算最大理論回收率，并能以簇狀柱形圖或復合圖等形式展現溶菌酶提取量與回收率的關系，綜合分析結果；實驗報告以研究論文的格式撰寫，重點包括研究進展，實驗方法以及結果分析討論，其主要目的在于考查，①對前期準備工作的完整總結；②完整真實的表述實驗的具體過程；③根據全班結果共享，能分析各種結果產生的原因，從全局上分析各個方案的優缺點，提出合理的設計方案和優化方案。

3.3 實驗教學效果

該實驗綜合考查了學生對蛋白質藥物的分離純化理論知識的掌握程度，和對多種純化方法的靈活運用能力。同時也考查了學生對實驗結果的綜合分析能力，①對相似方案結果分析能力的培養，學生4 人1組，全班通常有8～9 組，相似甚至相同的方案不可避免，學生通過比較相似/相同方案組實驗結果的差異，探討實驗過程中的細節和操作規范對實驗結果的影響；②對不同方案實驗結果分析比較能力的培養，學生通過共享不同方案的實驗結果，可了解提取同一種生物活性物質有多種方案，通過不同方案實驗結果差異大小的比較，可進一步深刻理解不同因素，不同方案對生物活性物質的提取量和活性的影響；③對結果綜合分析能力的培養，沒有生產實踐經驗的學生通常只單方面追求提取量或純度，學會用綜合性思維分析問題是解決生產實際問題的重要原則。實驗中學生的結果與標準方案間的巨大差異可進一步加深學生對這一思維的理解和應用，同時有利于培養學生的綜合設計能力和創造性思維；④通過整個實驗過程和結果總結，培養學生科學嚴謹的研究態度，啟發學生，任何不加理解、盲目機械照搬和不重視細節的研究態度都不會得到理想的實驗結果。

4 結語

該綜合性實驗包括文獻檢索，溶菌酶的制備，溶菌酶純度的定性鑒定以及酶活性檢測等內容，涉及化學與生物多個學科的知識，重點強調了生物分離技術中多種技術手段的靈活使用及現代化儀器和分析軟件的使用。生物技術、生物工程和制藥工程等專業的學生通過該實驗項目的訓練，可以培養文獻檢索能力、學生的團隊精神和大局觀，同時提高實驗綜合設計能力，分析問題和解決問題的能力。通過該綜合實驗，訓練學生嚴謹的科學思維和生物學思維，一方面激發學生的興趣，另一方面也為學生后期的專業方向選擇，畢業論文甚至未來的科學研究工作奠定基礎。