外周血來源外泌體中miR-21水平與2型糖尿病患者胰島素抵抗的相關性

陳建軍，王悅，王玉梅

胰島素抵抗是2型糖尿病（T2DM）發病的主要原因，患者血糖控制不佳常導致脂質代謝異常、血糖代謝紊亂、高血壓及動脈硬化的發生。有研究發現miR-21與多種炎癥疾病相關，可能通過炎癥途徑介導胰島素抵抗的發生[1]；也有研究報道T2DM患者外周血來源外泌體中miR-21表達水平明顯升高[2]，但與發生胰島素抵抗的關系尚不明確。本研究探討T2DM患者外周血來源外泌體中miR-21表達水平與胰島素抵抗的關系，旨在為T2DM的治療提供新的思路。現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集2017年7月至2019年7月浙江省安吉縣中醫醫院就診的43例T2DM患者為研究組，均符合2010年美國糖尿病協會（ADA）糖尿病診療指南中的診斷標準[3]。其中男28例，女15例；年齡44～74歲，平均（52.1±6.3）歲；病程1～8年，平均（4.16±1.14）年。另選取同期健康體檢者43例為對照組，男29例，女14例；年齡45～74歲，平均（49.3±6.1）歲。本研究納入對象均簽署知情同意書，并經醫院醫學倫理委員會審核通過。

1.2 方法

1.2.1 代謝指標檢測收集研究對象的體質量、身高及體質量指數（BMI）等資料，禁食12 h，清晨采血檢測空腹血糖（FPG）、空腹胰島素（FINS）、血清總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）及低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）。胰島素抵抗指數（HOMA－IR）=FPG（mmol/L）×FINS（mU/L）/22.5。采用酶聯免疫吸附（ELISA）法檢測患者血清中炎癥因子IL-6及IL-1水平。

1.2.2 外泌體的提取及鑒定無菌收集研究組及對照組外周血10 ml，3 000 r/min離心10min后，12000×g離心10min收集上清，以1∶5的比例加人ExoQuickTM試劑（美國SBI公司）混勻后靜置于4℃過夜。次日1 500×g離心30 min，棄上清，使用4℃預冷的磷酸鹽緩沖液（PBS）重懸底部沉淀，BCA蛋白定量后儲存于－80℃備用。使用醋酸雙氧鈾對外泌體進行染色，冷凍電鏡鑒定外泌體形態；使用Western-blot法檢測提取物中CD63、TSG101及Calnexin表達情況，所用抗體均購自美國Abcam公司，稀釋比例為1∶1 000。

1.2.3 RT-PCR檢測外泌體中miR-21表達水平吸取20 l外泌體溶液，使用PureLink RNA試劑盒（美國Thermo Fisher公司）提取外泌體中RNA，Nanodrop 2000檢測OD260/OD280＞1.8，將所得RNA逆轉錄成為cDNA模板，使用RTPCR技術檢測miR-21在外泌體中的表達水平，樣品均外送迪安醫學檢驗公司檢測。反應體系為20 l，包括上、下游引物各0.8 l、cDNA模板0.6 l、ddH2O 7.8 l、SYBRPPrimix Ex TaqTM10 l，反應條件95℃預變性10 min，95℃10 s，60℃60 s，共35個循環，以U6為內參，結果采用2－△△Ct法進行測定。所有引物均委托上海生工有限公司合成，miR-21引物為：F：5’-ATCCAGTGCGTGTCGTG-3’；R：5’-TGCTTAGCTTATCAGACTG-3’。U6引 物 為：F：5’-GCTTCGGCAGCA-CATA-3’；R：5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGT-3’。

1.3 統計方法采用SPSS 21.0統計軟件進行分析，計量資料以均數±標準差表示，采用t檢驗；相關性分析采用Spearman法，多因素分析采用Logistic回歸模型。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組臨床指標比較研究組BMI、FPG、FINS、TC、TG、LDL-C、HOMAIR、IL-6及IL-1均高于對照組，而HDLC水平低于對照組（均P＜0.05），見表1。

表1 兩組臨床指標比較

2.2 外泌體的鑒定電鏡下觀察外泌體為直徑100 nm左右的雙層膜圓盤狀小囊泡，Western-blot結果為CD63、TSG101均有表達，而Calnexin無表達，確定提取物為外泌體而非細胞成分。見封四彩圖6～7。

圖6 Western-blot技術檢測外泌體相關蛋白的表達

圖7 電鏡下外泌體形態鑒定

2.3 兩組外泌體中miR-21水平比較研究組外周血來源外泌體中miR-21相對表達量為（1.32±0.31），對照組miR-21相對表達量為（0.72±0.25），研究組miR-21水平高于對照組（t=9.836，P＜0.05）。

2.4 miR-21與代謝指標的相關性T2DM患者外周血來源外泌體中miR-21表達水平與BMI、FINS、FPG、HOMA-IR、IL-6及IL-1呈正相關（r=0.471、0.407、0.395、0.513、0.492、0.413，均P＜0.05），而與HDL-C呈負相關（r=－0.412，P＜0.05），與年齡及性別無關（r=0.102、0.097，均P＞0.05）。

2.5 影響HOMA-IR的相關因素將BMI、TC、LDL-C、HDL-C、IL-6、IL-1、miR-21納入多因素回歸模型中，采用逐步法進行檢測，結果顯示BMI（=0.475，95%CI：0.005～0.024，P=0.001）及miR-21（=0.262，95%CI：0.041～0.153，P=0.031）是HOMA-IR升高的獨立影響因素。

3 討論

糖尿病的發病與胰島素分泌不足和胰島素抵抗相關，并根據病因分為T1DM及T2DM，T1DM常見于自身免疫疾病導致的胰島B細胞破壞，而T2DM常見于內分泌因素導致的胰島B細胞功能失調及葡萄糖調節受損[4]。糖尿病會引起微血管、結締組織和神經發生病理改變，誘發一系列骨骼和肌肉異常，常導致患者出現疼痛甚至殘疾，危害患者健康。糖尿病常用藥為二甲雙胍、磺酰脲類及格列奈類等，主要作用為促胰島素分泌及提高胰島素敏感性，具有一定的副作用，且患者依從性不高，降低患者胰島素抵抗是近年來糖尿病治療領域的熱門研究。

外泌體是一種細胞分泌的微小囊泡，幾乎存在于所有真核生物，參與機體免疫應答和細胞間信號交流[5]。外泌體可攜帶多種生物信息分子，如miRNA、環狀RNA及多種蛋白質[6]，而且能穩定存在于細胞外液中，有利于生物學檢測。有研究表明外泌體能夠作為一些疾病診斷及治療的靶點而發揮作用[7]。miRNA是一種內源性短鏈非編碼RNA，參與細胞調控細胞生命活動和代謝過程，有研究表明miRNA還參與胰島素抵抗的發生[8]，和T2DM的發生密切相關。相關研究表明miR-21在T2DM患者血清中高表達，且對T2DM導致的急性心力衰竭具有診斷價值[9]。動物實驗發現下調小鼠胰島B細胞中miR-21水平能夠緩解胰島素抵抗，改善脂質代謝紊亂[10]。

本研究結果顯示外周血來源外泌體中miR-21表達水平與IL-6、IL-1及HOMA-IR呈正相關（均P＜0.05），與文獻[11]報道相似。本研究還發現miR-21為HOMA-IR升高的獨立危險因素。有研究表明miR-21是一種炎癥介質，在多種疾病中發揮促炎作用[12]，在T2DM中可能通過炎癥反應介導胰島素抵抗的發生及發展。這提示miR-21可能通過介導炎癥的發生，使胰島素抵抗水平升高，促進T2DM的發生及發展。