福建省七葉一枝花細菌性軟腐病病原鑒定

鄭梅霞，蘇海蘭，肖榮鳳，何桂強，朱育菁 *

（1. 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物資源研究所，福建 福州 350003；2. 井岡山自然保護區(qū)長古嶺林場，江西 井岡山 343600）

0 引言

【研究意義】七葉一枝花［Paris polyphylla Smith var. chinensis（Franch.）Hara］屬百合科重樓屬植物，是歷版《中國藥典》收載的兩種重樓藥材基原植物之一[1?3]。七葉一枝花根莖藥用歷史悠久，具有抗腫瘤、抗菌消炎等作用[4]。七葉一枝花人工種植過程中會出現(xiàn)軟腐病、葉斑病、莖腐病、根腐病等病害[5]，嚴重影響產(chǎn)量和質(zhì)量[6?9]。分析病害的發(fā)生特點，鑒定七葉一枝花病害的病原菌，對充分了解七葉一枝花病害從而采取針對性的防治措施具有重要意義。【前人研究進展】馬維思等[1]對滇重樓軟腐病菌進行分離鑒定，其致病菌為胡蘿卜軟腐果膠桿菌胡蘿卜亞種Pectobacterium carowvorum subsp. carotovorum。趙振玲等[10]對滇重樓的葉斑病進行分析，是由半知菌類的柱隔孢（Ramularia）引起的真菌性病害。滇重樓的根腐病主要由多種因素綜合引起，發(fā)生率一般為50%，嚴重可達87.7%[11]。【本研究切入點】目前，在福建省光澤縣七葉一枝花主要產(chǎn)區(qū)出現(xiàn)了軟腐病，造成生育期的七葉一枝花植株葉片腐爛、莖稈開裂、植株倒伏和塊莖腐爛，田間發(fā)病率約為5%～45%。已對七葉一枝花種植形成較大威脅。該病害在我省發(fā)生的情況還缺乏了解，尚無有效的防治方法。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究對七葉一枝花軟腐病的發(fā)生特點進行調(diào)查，并對病原菌進行分離鑒定，以期為該病的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

七葉一枝花軟腐病病株于2018～2019年采自福建省光澤縣福建承天農(nóng)林科技發(fā)展有限公司重樓規(guī)范化栽培基地。

LB：蛋白胨10.0 g，酵母浸粉5.0 g，NaCl 5.0 g，蒸餾水1000 mL，瓊脂17.5 g，調(diào)節(jié)pH值至7.0～7.2。主要試劑：無菌水、STE Buffer、Tris-平衡酚、氯 仿、TE Buffer。

1.2 方法

1.2.1 田間病害調(diào)查 2018—2019年，在福建省光澤多個七葉一枝花種植基地，采用田間調(diào)查法觀察發(fā)病植株的癥狀，了解七葉一枝花軟腐病的發(fā)生情況 和發(fā)病特點。

1.2.2 病原菌分離純化和保存 采用組織分離法進行病原菌的分離和純化。采集剛發(fā)生軟腐病的新鮮七葉一枝花葉片、莖稈，自來水沖洗干凈植株表面泥土后，酒精棉球擦拭干凈，將植株組織先用消毒后的刀片切去表皮，然后切病健交界處大小約為2 mm×2 mm×1 mm的薄片。將切成片狀的病組織在75%的酒精溶液中浸泡30 s，然后在1%的次氯酸鈉溶液中浸泡消毒5～8 min后，用無菌水漂洗3次，將植物組織片貼到LB平板表面，25 ℃倒置培養(yǎng)2 d，待培養(yǎng)物長出，采用稀釋劃線轉(zhuǎn)接到新的培養(yǎng)皿中。純化兩次，以甘油∶LB液=1∶4的比例存放在 ?80 ℃凍保存。

1.2.3 致病性測定 由于該植物對生長條件要求較為嚴格，室內(nèi)條件不容易培養(yǎng)，于4—5月選在田間獨立栽種的盆苗中處理，取16株長勢一致的7年生七葉一枝花，自來水沖洗去除表面泥土，分析選擇葉片或莖稈用毛刷把10?6cfu·mL?1濃度的菌液刷在表面，處理后的葉片與莖桿用濕紗布包住，培養(yǎng)2 d后，去除紗布繼續(xù)培養(yǎng)，以無菌水處理作為對照，觀 察發(fā)病情況。

1.2.4 病原菌鑒定 形態(tài)特征：經(jīng)致病性測定確認病原細菌后，透射電鏡觀察菌體特征。分子鑒定：利用細菌基因組提取試劑盒對純化菌株的菌液提取基因組，利用引物27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCT CAG-3'和1429R：5'-GGTTACCTTGTTACGA-3'聚 合酶鏈式反應(yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）擴增該菌株的16s rDNA片段，然后將 PCR 產(chǎn)物電泳后回收，送由基因公司測序[12]。將測序結(jié)果用 Blast 與NCBI 中的Gene Bank 數(shù)據(jù)庫中近緣菌株的 16 SrDNA進行同源性比對，使用 MEGA7 軟件進行系統(tǒng)進化樹的 構(gòu)建。

2 結(jié)果與分析

2.1 七葉一枝花軟腐病的特點及危害

七葉一枝花為草本宿根植物，一年出苗一次。從每年2月植株出苗開始，多雨時節(jié)可觀察到在葉片、莖稈和塊莖均有軟腐病發(fā)生，并且地溫在20 ℃～25 ℃或在25 ℃以上，通氣不良、田里積水，利于病害發(fā)生發(fā)展。軟腐病主要危害部位為葉片和莖部，葉片發(fā)病初期在受害部位出現(xiàn)水浸狀的壞死，病部很快擴大，感病部位內(nèi)部組織被細菌分解成液體狀態(tài)，病組織開始軟化、變色，病斑邊緣初有明顯界限，隨著病勢的發(fā)展界限逐漸模糊不清，然后軟腐（圖1-a、b）。莖稈發(fā)病初期在莖稈基部形成水浸狀病斑，后軟化，莖內(nèi)部開始腐爛，產(chǎn)生刺激性臭味，發(fā)病部位沿著維管束向上蔓延造成整個莖稈稀軟腐爛，葉片萎蔫、植株倒伏（圖1-c）。隨著病情的蔓延，七葉一枝花塊莖也會受到軟腐病的危害，軟腐組織呈棕褐色，被侵染組織和健康組織界限明顯，病斑邊緣有褐色或黑色的色素。腐爛早期無氣味，二次侵染后有臭氣、黏液、黏稠物質(zhì)（圖1-d）。

圖 1 七葉一枝花植株軟腐病發(fā)病癥狀Fig. 1 Symptoms of soft rot disease on P. polyphylla

2.2 致病性測定

植株接種后，接種葉片的植株第4 d開始發(fā)病，并逐漸向四周擴散蔓，于第7 d蔓延至全葉和莖桿，葉片呈水漬狀（圖2-a和圖2-b）。接種莖桿的植株第3 d開始發(fā)病，并逐漸向四周擴散蔓延，于第5 d導(dǎo)致莖桿開裂，內(nèi)部腐爛和軟腐，有菌濃流出（圖2-c）。從發(fā)病的組織中再次分離獲得的細菌，經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子鑒定，證明與所接病原菌一致。

圖 2 七葉一枝花植株人工接種致病癥狀.Fig. 2 Symptoms of soft rot disease on artificially inoculated P.polyphylla plant

2.3 病原菌形態(tài)特征

該菌在肉汁凍培養(yǎng)基上菌落圓形、光滑、乳白色、半透明，菌落邊緣光滑或呈波狀，菌落中央有略帶乳黃色的瘤狀突起（圖2）。七葉一枝花植株軟腐病病原細菌的透射電鏡掃描圖如圖3所示，菌體為兩端鈍圓呈短桿狀，大小1.4～2.4（平均1.6）μm × 0.4～0.6（平均 0.5）μm，具有2～8 根周生鞭毛（圖4）。

圖 3 植株軟腐病病原菌的菌落形態(tài)Fig. 3 Morphology of soft rot pathogen colonies

圖 4 植株軟腐病病原細菌形態(tài)特征Fig. 4 Morphology of soft rot pathogen

2.4 病原菌分子鑒定

代表性菌株FJAT-49333經(jīng)16SrDNA測序，并在NCBI 中的Gene Bank 數(shù)據(jù)庫中近緣菌株的 16 SrDNA進行比對發(fā)現(xiàn)與Pectobacterium carotovorum同源性均達到99%以上，發(fā)育樹圖如圖5所示。根據(jù)病原菌的形態(tài)特征，16S rDNA鑒定和致病性實驗，可將七葉一枝花軟腐病的病原菌鑒定為胡蘿卜軟腐果膠桿菌Pectobacterium carotovorum。

圖 5 七葉一枝花植株軟腐病病原細菌的發(fā)育樹Fig. 5 Pathogenic bacteria development tree of soft rot disease on P. polyphylla

3 討論與結(jié)論

七葉一枝花作為一種馴化時間較短的藥用植物，隨著人工種植種植面積的不斷增加，各種病害問題日漸凸顯[13?15]。細菌性軟腐病是世界性的重要細菌性病害之一，除危害白菜、甘藍、蘿卜、花椰菜等十字花科蔬菜外，還危害馬鈴薯、番煎、辣椒、大蔥、洋蔥、胡蘿卜、序菜、萵苣等煎科、豆科、傘形科和葫聲科的多種蔬菜以及馬蹄蓮、鸞尾、唐菖蒲等觀賞植物[16]。胡蘿卜軟腐果膠桿菌Pectobacterium carotovorum會引起茄子、番茄、辣椒和芹菜等多種作物發(fā)生軟腐病[17?19]，該類細菌性軟腐病是世界性重要病害之一[20?22]。胡蘿卜軟腐果膠桿菌Pectobacterium carotovorum寄主范圍和地理分布廣泛，是自然條件下普遍存在的植物病原菌，能侵染數(shù)百種蔬菜以及一些花卉植物，細菌性軟腐病具有發(fā)生范圍廣和難以防治的特點[23?24]。楊鐘靈等[19]研究表明，胡蘿卜軟腐果膠桿菌可以引起黃花馬蹄蓮的軟腐病。晉知文等[25]研究表明，胡蘿卜軟腐果膠桿菌可以引起芹菜軟腐病。

本研究首次分離鑒定了七葉一枝花軟腐病的病原菌，為胡蘿卜軟腐果膠桿菌Pectobacterium carotovorum。通過對七葉一枝花細菌性軟腐病的分離與鑒定以及對七葉一枝花軟腐病發(fā)生時進行田間調(diào)查，明確了其致病菌為胡蘿卜軟腐果膠桿菌Pectobacterium carotovoru。田間栽培時應(yīng)注意加強通風(fēng)、清除積水，及時清除病株，以減輕田間七葉一枝花軟腐病的發(fā)生和蔓延。本研究對下一步研究七葉一枝花細菌性軟腐病的有效防治方法提供前期理論基礎(chǔ)。