太子參根際土壤微生物多樣性及其與土壤主要理化因子的相關性

高慧芳，許佳音，孟 婷，陳金紹，邱君志，張重義，張燎原

（1. 福建農林大學生命科學學院，福建 福州 350002；2. 廈門大學附屬第一醫院藥劑科，福建 廈門 361022；3. 廈門中藥廠有限公司，福建 廈門 361002；4. 福建農林大學農學院，福建 福州 350002）

0 引言

【研究意義】太子參（Pseudostellaria heterophylla）別名孩兒參、童參，為石竹科多年生草本植物，以根部入藥，具有抗疲勞、抗衰老、調脾虛體倦等功效[1]。太子參以福建省柘榮縣栽培歷史最為悠久，其品質優良，年產量約占全國總產量的60%，素有“中國太子參之鄉”的美譽，并于1987年列為太子參的最佳生長適宜區、中國太子參生產基地[2]。近年來，太子參醫藥價值開發日益深入，其原藥材的需求量迅速增加，價格不斷攀升，給太子參產業化發展帶來重要機遇。但由于太子參在栽培過程中存在的連作障礙問題，嚴重影響其產量和品質[3?4]。太子參連作障礙主要表現為塊根重下降、分根數減少特別是地下部位不能正常膨大，從而不能形成具有商品價值的塊根。【前人研究進展】前期研究發現，土壤肥力、植物根系分泌物和根際微生物種群的失衡，是導致太子參連作障礙的主要原因[5]。而根系分泌物介導的根際微生物種群失衡，尤其是病原微生物的增多，成為太子參連作效應發生的重要原因[6?8]。微生物與土壤生態功能是相輔相成、息息相關的，并且跟植物之間有著緊密關聯。微生物群落的組成及其多樣性是衡量土壤性質和功能的一個重要指標。有研究發現[9]，太子參連作及菌肥處理會顯著影響太子參根際土壤微生物的群落結構與功能多樣性，推測微生態結構失衡是導致太子參連作效應形成的根本原因。而不同產地的太子參根際土壤微生物的含量及群落結構存在較大差異性[10]。【本研究切入點】柘榮縣由于特殊的地理位置，不同太子參種植地土壤性質、氣候環境、海拔等因素有所差別，但栽培過程中都存在不同程度的連作問題。不同的栽培過程是否導致菌群結構的變化，存在哪些共性和差異性，這些共性是否是引起連作問題、病害增多的原因。【擬解決的關鍵問題】本研究基于高通量測序技術，研究柘榮縣5個不同樣地太子參根際土壤微生物群落結構及多樣性，并分析土壤pH值和主要化學性質及太子參根系分泌物酚酸類物質對其的影響，以期揭示太子參栽培過程中病害形成存在的共性及差異性問題，為科學種植太子參并提高其產量及品質提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 研究區概況

福建省寧德市柘榮縣，地理位置為N27°05′～N27°19′，E119°43′～E120°04′，屬于亞熱帶季風氣候，溫和濕潤，年平均氣溫15.5 ℃，雨量充沛，年平均降水量為1 600～2 400 mm，平均相對濕度約為85.00%，雨日多雨區廣，11～2月少雨，3～6月多雨[2]，為 太子參提供良好的種植條件。

1.2 試驗樣品采集

于2018年6月25日進行柘榮縣太子參根際土壤的采集：選擇植株健壯的太子參，除去表層土壤，找到植物根系，輕輕抖落根系上的土壤于無菌采集袋中，做好采樣記錄。將每個樣地的太子參根際土壤取5組混為1個樣品，每處樣地設3次重復，分別進行理化性質的測定、根系分泌物的檢測和土壤宏基因組DNA的提取。5個樣地序號為：Ⅰ（英山鄉油麻厝村）；Ⅱ（東源鄉鴛鴦頭村）；Ⅲ（東源鄉綢嶺村）；Ⅳ（東源鄉東源村）；Ⅴ（乍洋鄉束劉厝村）。5個樣地的地形為中山丘陵，成土母質為坡積母 質，質地是中壤類型[11]，詳細信息如表1所示。

1.3 高通量測序及分類注釋

以提取的宏基因組DNA為模板，分別擴增真菌ITS1區和細菌16S rDNA V3～V4區，基于Miseq平臺進行高通量測序，測序工作由杭州聯川生物技術股份有限公司完成。根據測序下機數據，進行質量控制，采用PEAR（Paired-End reAd mergeR，version 0.9.6）和Vsearch（version 2.3.4）軟件過濾原始的測序數據，得到有效序列（Valid_Data），并將有效序列在大于97.00%相似性條件下進行聚類OTU（Operational Taxonomic Units，操作分類單元），通過RDP數據庫進行物種注釋，并得到每個物種在該樣品中的豐度。利用QIIME軟件計算樣品中的Alpha多樣性值和Beta多樣性值，并進行聚類分析。計算差異種群兩兩間的Spearman秩相關系數，借助Gephi（Version 0.9.2）軟件構建差異種群共變化網絡，進一步探究差 異種群間的相互關系。

1.4 土壤pH值及主要化學性質的測定

測定采集土樣的理化性質，土壤pH值采用電位計法（水土質量比2.5∶1）；土壤有機質（Organic Matter,OM）采用外加熱重鉻酸鉀氧化-容量法；土壤全氮（total nitrogen, TN）采用碳氮元素分析儀（VARIO MAX, 德國ELEMENTAR）測定[12]；土壤銨態氮（ammonium nitrogen, NH4+）采用靛酚藍比色法；土壤全磷（total phosphorus, TP）采用氫氧化鈉熔融-鉬銻抗比色法；土壤有效磷（available phosphorus, AP）采用碳酸氫鈉浸提-鉬銻抗比色法；土壤全鉀（total potassium, TK）采用堿熔-火焰光度法；土壤速效鉀（available potassium, AK）采用乙酸銨浸提-火焰光度法[13]。

表 1 太子參根際土壤樣品信息Table 1 Information on soils sampled from rhizosphere of P. heterophylla habitats

土壤中有效態銅、有效態鋅和有效態鐵用0.10%HCl浸提，土壤中有效態錳采用醋酸銨浸提法，并使用電感耦合等離子質譜（ICP-MS，NexION 300X，PerkinElmer）測定[14]。條件參數：功率為1 300 W，等離子氣流量為13.00 L·min?1，輔助氣流速為1.40 L·min?1，氦氣流量為5.20 L·min?1，氫氣流速為5.80 L ·min?1，采用深度為7.80 mm，重復采樣3次。

1.5 土壤酚酸類物質的檢測

土樣的前期處理參考吳丹等[15]的相關方法，樣品旋蒸后用甲醇定容至5 mL后用高效液相色譜進行檢測。9種常見酚酸為對羥基苯甲酸、香草酸、丁香酸、香蘭素、香豆酸、阿魏酸、苯甲酸、水楊酸及肉桂酸，溶解于甲醇作為標品進行HPLC檢測。前期實驗優化后的色譜條件：色譜柱（SunFire C18 5 μm,4.6 mm×250 mm Column），流動相A為0.1%磷酸，流動相B為甲醇，0～6 min（A：73.00%；B：27.00%），6～22 min（A：50.00%；B：50.00%）檢測波長280 nm，進樣量10 μL，柱溫30℃。儀器為Waters e2695-Model C ode 998。

1.6 數據處理

采用Excel 2016和SPSS 17.0軟件對數據進行單因素（one-way ANOVA）方差分析和Duncan法多重比較分析（a=0.05）。采用Adobe Photoshop CS6軟件作 圖。采用Canoco 5軟件進行典范對應（CCA）分析。

2 結果與分析

2.1 太子參根際土壤測序的有效數據

5個樣地的太子參根際土壤經測序后共得到744 331條真菌基因優化序列，按照97.00%序列相似性基礎，可劃分為1 314個真菌分類單元（OTU）：14門（Phylum），44綱（Class），87目（Order），157科（Family），275屬（Genus），396種（Species）；共得到1 032 029條細菌基因優化序列，按照97.00%序列相似性劃分10 310個細菌分類單元（OTU）：38門（Phylum），101 綱（Class），160 目（Order），263科（Family），484屬（Genus），554種（Species）。如圖1-A和1-B所示，真菌和細菌的OTU豐度存在不同程度的差異。1-A所示，5組之間只有Ⅰ組和Ⅱ組真菌OTU豐度呈顯著差異性；1-B所示，Ⅳ組的細菌OTU豐度最高；Ⅲ組的細菌OTU豐度最低，與Ⅰ、Ⅱ組的細菌OTU豐度有顯著差異性；而Ⅲ組和Ⅳ組的細菌OTU豐度呈極顯著差異。不同樣地的真菌OTU豐度與細菌OTU相比，5組之間的細菌OTU豐度呈現更明顯的差異性。說明不同栽培地對太子參根際土壤細菌的影響大于對其真菌的影響，且太子參根際土壤微生物以細菌為主。

通過對韋恩圖中各樣品特有的或共有的真菌OTU數進行分析，如圖1-C所示，5個樣地的樣品中真菌共有OTU數達到264個。其中，Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ4組的共有真菌OTU為99，說明這4組的真菌群落結構相似性高；Ⅰ、Ⅱ 和Ⅳ三者共有的真菌OTU為40，說明這3組的真菌群落結構相似性較高；Ⅲ和Ⅳ這兩者的共有真菌OTU為64，說明這2組的真菌群落結構相似性較高；Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ特有真菌OTU分別為31、22、121、45、72，分別占其OTU總數的4.03%、3.12%、16.31%、5.45%、9.36%。而5個樣地共有真菌OTU數均高于其他的隨機組合共有真菌OTU，表明不同樣地的微生物物種相近。

從圖1-D可以看出，5個樣地土壤細菌共有OTU數為2 044；Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ和Ⅴ四組的共有細菌OTU為2 109，說明這4組的細菌群落結構相似性高；Ⅰ、Ⅱ和Ⅳ三者共有的細菌OTU為873，說明這3組的細菌群落結構相似性較高；Ⅰ和Ⅳ這兩者的共有細菌OTU為250，說明這2組的細菌群落結構相似性較高；Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ特有細菌OTU分別為140、49、396、311、161，分別占各太子參細菌OTU總數的1.87%、0.66%、8.68%、3.81%、2.37%。

從圖1綜合分析，單個樣地的OTU數均不同，其中單個樣地的OTU數Ⅲ為最多（真菌121個，細菌396個），Ⅱ最少（真菌22個，細菌49個），說明不同樣地太子參根際土壤中各自特有的微生物不同，存在差異性；而5個樣地的共有OTU數明顯多于特有的數量，說明5個樣地的根際土壤微生物組成 趨勢相似。

圖 1 真菌和細菌的OTU豐度及韋恩圖（AB：箱線圖；CD：韋恩圖）Fig. 1 OTU richness and Venn diagrams on fungi and bacteria in rhizosphere soil (AB: Box-plot; CD: Venn diagrams)

2.2 5個樣地太子參根際土壤微生物群落豐度與多樣性

比較5個樣地太子參根際土壤微生物群落的α多樣性，其中Observed-species指數、Chao1指數越高，說明物種多樣性越好，物種越豐富；Simpson指數和Shannon指數越高，說明物種豐富度和均勻度越好。如表2所示，結果發現，太子參根際土壤細菌群落的Observed-species指數和Chao1指數呈明顯的差異性。其中Ⅳ、Ⅱ土壤中細菌有著較高的Observed_species指數、Chao1指數和Shannon指數，說明樣地Ⅳ、Ⅱ土壤的細菌群落豐富度和多樣性高于其他3個樣地；Ⅲ土壤的多樣性指數均呈現較低值，說明此樣地土壤菌群豐富度和多樣性較低。總之太子參根際土壤中細菌群落多樣性呈現趨勢為：Ⅳ＞Ⅱ＞Ⅰ＞Ⅴ＞Ⅲ，5個樣地太子參根際土壤的細菌群落豐富度及均勻性存在顯著差異，而真菌群落差異不明顯。

主坐標分析圖上點與點之間的距離越近，說明樣品之間的微生物群落差異越小。由圖2可以看出，真菌第一軸的解釋量為27.25%，第二軸的解釋量為13.95%，第一、二兩軸的累積貢獻率達到41.20%；細菌第一軸的解釋量為38.67%，第二軸的解釋量為12.80%，第一、二兩軸的累積貢獻率達51.47%，可以較為全面反映樣本信息。圖2-A中，其中Ⅳ、Ⅰ、Ⅱ之間的點距離較近，說明3個樣地的微生物群落構成相似。而Ⅲ、Ⅴ的3個點與其他樣地的點之間距離較遠，說明Ⅲ、Ⅴ與其他樣地的微生物群落構成差異較大。從圖中可以看出，無論是真菌或者細菌群落，Ⅳ、Ⅰ、Ⅱ這3個樣地之間距離較近，說明每組內的群落構成相似性較高；而Ⅲ與其他樣地距離較遠，說明該樣地的微生物群落與其他樣地的微生物群落構成相似性較低。

基于Unifrac距離矩陣進行UPGMA聚類分析，如圖3所示，將5組樣品劃分為2個類群。第一類群包括Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ四組樣品，說明這4個樣地太子參根際土壤微生物群落相似性較高；第二類為Ⅲ樣地樣品，與第一類樣品整體距離較遠，說明Ⅲ樣地樣品與其他4組樣地太子參根際土壤微生物群 落差異較大。

表 2 樣品α多樣性指數Table 2 α diversity indices on 5 rhizosphere soil samples at P. heterophylla habitats

圖 2 主坐標分析太子參根際土壤真菌和細菌群落差異Fig. 2 Principal coordinates analysis on fungi and bacteria communities in rhizosphere soil of P. heterophylla habitats

2.3 微生物群落結構分析

為了反映太子參根際土壤微生物群落組成的相似性和差異性，對OTU進行物種分類后首先在“門”分類等級對5個樣地的菌群結構進行分析。如圖4-A所示，聚類后OTU對應的真菌類群涉及子囊菌門（Ascomycota）、擔子菌門（Basidiomycota）、接合菌門（Zygomycota）、被孢菌門（Mortierellomycota）、毛霉門（Mucoromycota）、類原生動物門（Rozellomybota）、球囊菌門（Glomeromycota）、壺菌門（Chytridiomycota）、芽枝菌門（Blastocladiomycota）、油壺菌門（Olpidiomycota）、Aphelidiomycota、捕 蟲 菌 門（Zoopagomycota），一個門未被鑒定unidentified，一個門未被分類fungi_unclassitied。其中子囊菌門（Ascomycota）、擔子菌門（Basidiomycota）、接合菌門（Zygomycota）在5個樣地的含量都很高；子囊菌門（Ascomycota）在Ⅴ根際土壤中的含量為最高，在Ⅲ根際土壤中含量較低；擔子菌門（Basidiomycota）在Ⅲ根際土壤中的含量為最高，在Ⅴ根際土壤中含量較低；接合菌門（Zygomycota）在 Ⅰ 根際土壤中含量為最高，在Ⅴ根際土壤中的含量較低，說明不同樣地的微生物群落豐度存在差異。

圖 3 UPGMA 聚類分析Fig. 3 Cluster analysis of UPGMA

圖 4 太子參根際土壤優勢微生物群落組成Fig. 4 Compositions of dominant microbial communities in rhizosphere soil of P. heterophylla habitats

如圖4-B所示，在細菌“門”的分類水平上，5個樣地太子參根際土壤在細菌菌落的組成上并無較大差別，且在細菌菌群結構和相對豐度上差異也較小。在5個樣地的太子參根際土壤中有6個“門”的細菌菌群分布最多：變形菌門（Proteobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）、后壁菌門（Firmicutes）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）。其中變形菌門（Proteobacteria）在5個樣地的豐度最高，并在Ⅲ的太子參根際土壤中含量占據首位。酸桿菌門（Acidobacteria）在5個樣地的豐度有所差異，其中在Ⅳ和Ⅱ的太子參根際土壤中含量相似且豐度較高，在Ⅲ土壤中的含量為最少。而放線菌門（Actinobacteria）在Ⅲ土壤中含量最高，在Ⅳ和Ⅱ的土壤中含量相對較低。綠彎菌門（Chloroflexi）和后壁菌門（Firmicutes）在5個樣地的土壤中含量基本持平。總的來說，在“門”分類水平上，5個樣地的優勢菌群保持一致，說明在“門”水平，太子參根際土壤微生物群落組成具有相似性。

豐度熱圖是對豐度最高的前20種物種分類信息進行相似性聚類，比較在不同樣地之間“屬”的含量差異，從圖4-C中可以看出，正青霉屬（Eupenicillium）、隱球菌屬（Cryptococcus）、柄孢殼屬（Podospora）、被孢霉菌屬（Mortierella）、田頭菇屬（Agrocybe）在樣地Ⅰ中豐度較高，腐質霉屬（Humicola）、Ascomycota_unclassified、肉座菌屬（Hypocrea）在樣地Ⅴ中豐度較高，粉褶蕈屬（Entoloma）在樣地Ⅱ豐度較高，雙擔菌屬（Geminibasidium）、瘦臍菇屬（Rickenella）在樣地Ⅲ中豐度較高，赤霉屬（Gibberella）、毛殼菌屬（Chaetomium）、鐮刀菌屬（Fusarium）、捷別爾達孢屬（Teberdinia）在Ⅳ中豐度較高。由此可見，同一菌屬在不同樣地的豐度存在差異性。如圖4-D所示，同一細菌物種在不同樣地間的豐度亦存在差異，如Gp2、Gp3在樣地Ⅳ中豐度較高，芽單孢菌屬（Gemmatimonas）在樣地Ⅱ中豐度較高，但是它們在其他樣地中豐度均較低；對各樣品進行聚類發現，Ⅱ和Ⅳ為一類，此結果與細菌群落組成及分布圖一致。

表3展示的是不同樣地間太子參根際土壤真菌群落中前20種優勢分類單元及其相對豐度。可以看出，Ⅰ樣地的優勢“屬”是被孢霉屬（Mortierella）、腐質霉屬（Humicola）、柄孢殼屬（Podospora）等；Ⅱ樣地的優勢“屬”是被孢霉屬（Mortierella）、粉褶蕈屬（Entoloma）、腐質霉屬（Humicola）等；Ⅲ樣地的優勢“屬”是瘦臍菇屬（Rickenella）、雙擔菌屬（Geminibasidium）、被孢霉屬（Mortierella）等；Ⅳ樣地的優勢“屬”是被孢霉屬（Mortierella）、赤霉屬（Gibberella）、捷別爾達孢屬（Teberdinia）等；Ⅴ樣地的優勢“屬”是腐質霉屬（Humicola）、被孢霉屬（Mortierella）等。總體來看，不同樣地的優勢“屬”不同，同種“屬”在不同樣地間的豐度不同，但差異不明顯，說明不同樣地的太子參根際土壤的微生物真菌群落趨于一致。

如表4所示，在細菌“屬”水平，可能是測序原因（由于微生物種類繁多，加之受到測序讀長的顯示，所以在實際分析過程中，并非所有的OTU代表序列都能獲得“屬”水平的分類學信息），在前20個優勢屬中，只鑒定得到7種，它們為酸桿菌（Gp1、Gp2、Gp3），羅河桿菌屬（Rhodanobacter）、芽單胞菌屬（Gemmatimonas）、纖線桿菌屬（Ktedonobacter）、勒氏菌屬（Gaiella）；將每個菌屬在不同樣地進行比較可以看出，芽單胞菌屬（Gemmatimonas）在Ⅱ的含量多于其他樣地；羅河桿菌屬（Rhodanobacter）在Ⅲ的含量明顯多于其他樣地；酸桿菌（Gp1）在5個樣地的含量均較高，而酸桿菌（Gp2、Gp3）在Ⅳ的含量高于其他4個樣地；纖線桿菌屬（Ktedonobacter）在Ⅴ、Ⅰ的含量較高，在Ⅲ的含量較低。同種“屬”在不同樣地間的豐度不同，結果表明，5個樣地的微生物菌屬豐度存在差異性，說明不同樣地太子參根際 土壤微生物群落結構不同。

2.4 5個樣地太子參土壤化學性質和酚酸含量分析

從表5看出，不同樣地太子參根際土壤化學性質均存在差異性。太子參根際土壤偏酸性，pH值為4.8～5.3。在Ⅱ和Ⅴ2個樣地，土壤有機質、全氮、全鉀含量均較高；在樣地Ⅲ中全磷、速效鉀含量最高，而有機質、全鉀指標與其他4個樣地相比含量較低。從表6得出，有效態微量元素在樣地Ⅲ中的含量均較低。其中：有效態錳在Ⅳ中含量最高，為23.14 mg·kg?1；有效態銅、有效態鐵在Ⅰ中含量最高，分別為4.18 mg·kg?1和151.94 mg·kg?1；有效態鋅在Ⅱ中含量最高，為13.19 mg·kg?1；其中有效態錳和有效態銅含量不同樣地差異顯著。表明不同樣地太子參根際土壤化學性質存在差異性，說明不同樣地太子參的種植會對太子參根際土壤的化學性質產生影響。

表 3 不同樣地太子參根際土壤真菌群落中前20種優勢分類單元及其相對豐度Table 3 Top 20 dominant taxa and their relative abundance of fungi community in rhizosphere soil of P. heterophylla habitats

如表7、8所示，5個樣地太子參根系分泌物中均含有對羥基苯甲酸、香草酸、丁香酸、香蘭素、香豆酸、阿魏酸、苯甲酸、水楊酸和肉桂酸。其中，5個樣地中對香豆酸、安息香酸、丁香酸的總含量高于其他6種，肉桂酸的含量最低；丁香酸、對羥基苯甲酸、對香豆酸、香蘭素在5個樣地中含量差異明顯。總之，同一酚酸在不同樣地含量不同，同一樣地的不同酚酸含量也存在差異性。說明不同樣地太子參根系分泌物中酚酸種類相同，但含量會有 所差異。

2.5 網絡關系圖

網絡關系圖被廣泛應用于復雜微生物群落的探究中。以上研究表明：不同樣地太子參根際土壤的微生物菌屬分布及豐度差異顯著。為進一步探究太子參根際微生態環境中微生物間的相互作用，本研究通過對差異菌屬兩兩間相關系數的計算，構建共變化網絡（圖5），在真菌菌屬共變化網絡中，核心菌屬是捷別爾達孢屬（Teberdinia）、稻曲菌屬（Villosiclava）；在細菌的共變化網絡系統中，核心菌屬是酸桿菌（Gp1、Gp3）和羅思河小桿菌屬（ Rhodanobacter）。

2.6 不同樣地太子參根際土壤微生物群落分布、土壤化學性質及酚酸典范對應分析

選取真菌的前3優勢“門”-子囊菌門（Ascomycota）、擔子菌門（Basidiomycota）、接合菌門（Zygomycota）和細菌的前4優勢“門”-變形菌門（Proteobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi），探討太子參根際土壤微生物豐度、根際土壤化學性質及酚酸類物質的典范對應分析。如圖6-A、6-B所示，子囊菌門（Ascomycota）豐度與根際土壤大部分化學性質、酚酸物質呈正相關關系，與全磷、有效磷、對羥基苯甲酸、香草酸呈負相關關系；而擔子菌門（Basidiomycota）豐度與大部分根際土壤化學性質、酚酸物質呈負相關關系，與全磷、有效磷、對羥基苯甲酸、香草酸呈正相關關系；接合菌門（Zygomycota）豐度與有效態銅、銨態氮、對羥基苯甲酸、丁香酸、安息香酸呈正相關關系。圖6-C和6-D所示，放線菌門（Actinobacteria）豐度與速效鉀、全磷呈正相關關系，與酚酸物質呈負相關關系；綠彎菌門（Chloroflexi）豐度與有效態鐵、對羥基苯甲酸呈正相關關系；變形菌門（Proteobacteria）豐度與銨態氮、有效磷、水楊酸呈正相關關系；酸桿菌門（Acidobacteria）豐度與根際土壤大部分化學性質和酚酸物質呈正相關關系，與全磷、有效磷、速效鉀、水楊酸呈負相關關系。典范對應分析表明太子根際土壤微生物群落分布受土壤理化性質及酚酸類物質的影響，說明太子參土壤化學性質及酚酸類物質參與了根際微生物群落結構及多樣性的演變。

表 4 不同樣地太子參根際土壤細菌群落中前20種優勢分類單元及其相對豐度Table 4 Top 20 dominant taxa and their relative abundance of bacteria community in rhizosphere soil of P. heterophylla habitats

表 5 不同樣地太子參根際土壤化學性質Table 5 Chemical properties of rhizosphere soil from P. heterophylla habitats

表 6 不同樣地太子參根際土壤中有效態微量元素的含量Table 6 Content of available trace elements in rhizosphere soil of P. heterophylla habitats

表 7 不同樣地太子參根系分泌物酚酸的含量Table 7 Content of phenolic acids in root exudates of P. heterophylla at different locations

表 8 不同樣地太子參根系分泌物酚酸的含量Table 8 Content of phenolic acids in root exudates of P. heterophylla at different locations

圖 5 太子參根際差異微生物共變化網絡圖Fig. 5 Co-occurrent network of microorganisms in rhizosphere soil of P. heterophylla habitats

圖 6 太子參根際土壤微生物群落分布、化學性質和酚酸物質的典范對應分析Fig. 6 Canonical correspondence analysis on community distribution, chemical properties and phenolic acids in rhizosphere soil of P. heterophylla habitats

3 討論與結論

許多作物都存在連作效應，尤以藥用植物表現最為突出，約占70.00%的以根部入藥的藥用植物存在不同程度的連作效應，如太子參、澤瀉、三七、地黃等均存在嚴重的連作效應問題[16]。根際是土壤與植物根系之間緊密結合的環境，同時也是土壤-根系-微生物三者緊密結合、相互影響的場所[17]。鄒立思[10]等研究發現，太子參根際土壤微生物以細菌為主，還包含放線菌及真菌，這與本研究不同樣地太子參根際土壤的細菌數目明顯多于真菌結論一致。5個樣地的優勢屬中的鐮刀菌屬（Fusarium）和赤霉屬（Gibberella）為常見的真菌致病菌。在藥用植物中，鐮刀菌成為主要的致病菌對象[18]。薛彩云等[19]研究發現，鐮刀菌屬對二年生的五味子造成嚴重的莖基腐病病害，會在生產上造成嚴重的經濟損失。劉西莉等[20]研究發現，鐮刀菌可引起嚴重的根腐病，直接影響麻黃的產量和品質。Chen等[21]、Wu等[22]研究發現，連作太子參根際土壤隨著連作年限增加，致病菌鐮刀菌數量增高，酚酸混合物可促進鐮刀菌菌絲和孢子生長。說明鐮刀菌屬是引起太子參連作效應的一類致病真菌。如表3所示，5個地區均含有鐮刀菌屬，但每個地區的鐮刀菌豐度有所差別，其中Ⅳ樣地的鐮刀菌豐度最高，其后依次為Ⅱ、Ⅰ、Ⅴ，Ⅲ樣地的鐮刀菌豐度最低，且每個樣地的鐮刀菌含量與其根際土壤其他微生物物種數呈反比，暗示鐮刀菌影響太子參根際土壤其他微生物物種數組成，響應太子參的連作效應。赤霉菌屬是玉米、水稻和小麥等禾本科植株的主要致病真菌，可導致作物嚴重減產[23]。目前太子參的連作過程中關于赤霉菌的研究較少，對引起太子參連作效應的致病真菌應引起關注。被孢霉屬（Mortierella）和腐質霉屬（Humicola）是一種常見的腐生真菌。稻曲菌屬（Villosiclava）可侵染水稻小穗引起穗部病害[24]。試驗發現5個樣地的差異性真菌屬為毛殼菌屬（Chaetomium）、捷 別 爾 達 孢 屬（Teberdinia）、Sordariales_unclassified、田頭菇屬（Agrocybe）、稻曲菌屬（Villosiclava）等。而在真菌菌屬共變化網絡中，核心菌屬是捷別爾達孢屬（Teberdinia）、稻曲菌屬（Villosiclava）。說明差異菌屬在太子參根際微生態環境中起到一定的作用。5個樣地太子參根際土壤細菌群落在“屬”分類水平的前20種優勢菌屬中，酸桿菌門的酸桿菌（Gp1、Gp2、Gp3），可以降解植物殘體多聚物，參與鐵循環和光合作用等，是具有促進作用潛力的一類菌[25]。芽單孢菌屬（Gemmatimonas）參與固氮過程[26]。

植物根際微生物的群落構建受到根系分泌物、土壤化學性質等的影響[27]。花生根系分泌物中的苯甲酸增加了根際土壤中伯克霍氏菌的相對豐度[28]。Wu等[29]研究發現，太子參根系分泌物酚酸和有機酸等物質對于其根際土壤微生物群落結構有重要影響。本研究中5個樣地的太子參根際土壤微生物群落分布與根際土壤化學性質、根系分泌物酚酸類物質都有一定的相關性。有研究表明，黏質沙雷氏菌可對太子參組培苗產生致害作用，導致根部腐爛和葉片枯萎[30]；太子參根系分泌物酚酸類物質促進微生物病原菌黏質沙雷氏菌（Serratia marcescens）生長并使其成為優勢菌[31?32]。而此次的測序結果中并未檢測到黏質沙雷氏菌，這可能與不同地區的太子參根際土壤微生物存在差異有關。

綜上所述，植物根際微生物群落結構及多樣性對植物的健康生長有著極其重要的作用。本文通過研究柘榮縣5個樣地的太子參根際土壤微生物群落結構及多樣性，發現不同樣地微生物群落結構及組成豐度存在共性及差異性，暗示真菌致病菌鐮刀菌屬等影響太子參根際土壤微生物結構組成及豐度多樣性。同時，太子參根際土壤微生物群落分布受到根際土壤化學性質及根系分泌物酚酸類物質的影響，暗示太子參土壤連作效應很可能歸因于根系分泌物參與調控根際微生物菌群結構和多樣性演變，導致病原菌增多。所得結果為后續連作太子參根際土壤微生物群落分布、太子參連作效應及相關根際致病菌的研究奠定了一定的工作基礎。