基于可控/“活性”自由基聚合的生物傳感分析

胡瓊，甘世宇，包宇，韓冬雪，牛利

（廣州大學化學化工學院，分析科學技術研究中心，廣東廣州510006）

蛋白質和核酸等生物分子的簡便、快速、低成本、高靈敏和高選擇性檢測[1]一直是生物傳感和生物分析等領域的一個重要研究熱點，在環境監測[2]、生化戰劑偵檢[3]、食品安全[4]、發酵工業[5]、生物醫學研究[6]以及臨床診斷[7]等領域具有廣闊的應用前景。為滿足實際樣品中低濃度生物分子的檢測需求，迄今為止，研究人員已經探索建立了一系列信號放大策略，使得檢測靈敏度獲得了極大的提高。其中，基于可控/“活性”自由基聚合（controlled/“living”radical polymerization，CLRP）技術的信號放大策略，由于具有操作簡便、成本低廉和高效等優良特性，在生物分子的高靈敏檢測中具有相當廣闊的應用前景。

1 生物傳感器的概念及特點

生物傳感器（biosensor）是將生物活性材料（如核酸等）、生物衍生材料（如適配體等）或仿生材料（如印記聚合物等）作為固定化分子識別元件與適當的傳感微系統［如場效應管（FET）等］或理化換能部件集成的對靶物質敏感并能將其濃度信號轉換為熱學、壓電、電、磁、光學或微觀機械等可檢測信號的分析工具或平臺（圖1）。具有檢測成本低廉、響應快速、設備簡單、靈敏度高、選擇性好、操作簡便等優良特性，在惡性腫瘤等重大疾病的早期診斷、食品安全和環境監測等領域獲得了廣泛的應用[8]。

2 傳統信號放大策略

在疾病的早期診斷等領域的實際樣品中，靶生物分子的含量可能處于極低的水平（臨床相關小分子、蛋白質和核酸的質量濃度參考范圍見文獻[9]）。以循環腫瘤DNA（ctDNA）為例，其在人血漿中的含量僅為1810～12639拷貝/mL[10]。為實現生物分子的高靈敏檢測，傳統策略通常是借助于使用催化反應或標記納米材料來對檢測信號進行放大。

圖1 生物傳感器的組成與應用

圖2 基于天然酶[14]、仿生催化[20]、電催化[21]和納米材料[24]的信號放大策略

基于催化反應的信號放大策略可分為使用天然酶［如堿性磷酸酶（ALP）[11]、辣根過氧化物酶（HRP）[12]、核酸外切酶Ⅲ（ExoⅢ）[13]、切刻內切酶[14]等］、仿生催化劑[15]以及具有電催化活性的納米材料[16]三類。其中，天然酶由于具有選擇性好、催化效率高以及反應條件溫和等優點，在生物分子的高靈敏檢測中獲得了廣泛的應用[17-18]。例如，Xue等[14]借助于切刻內切酶輔助的目標循環引發的熒光信號放大作用，實現了凝血酶濃度的高靈敏熒光分析，檢測下限為100pmol/L［圖2(a)］。不過，利用天然酶來進行信號放大，存在檢測成本高昂、穩定性差（酶易變性失活）以及標記過程復雜等不足。為克服上述缺陷，近年來，金屬卟啉等仿生催化劑[19]以及各種具有電催化活性的納米材料[16]由于具有廉價易得（可化學合成）、化學性質穩定以及標記過程簡單等優勢，已被大量用作天然酶的替代物來對檢測信號進行放大。例如，Ling等[20]報道了一種發卡型電化學生物傳感器，對單鏈DNA（ssDNA）濃度進行高靈敏檢測，檢測下限為0.48fmol/L［圖2(b)］。在該方法中，研究人員首先將發卡ssDNA片段固定在玻碳電極（GCE）表面作為捕獲探針，其與靶ssDNA的雜交反應引起發卡環發生構像變化形成鏈霉親和素（SA）的適配體，接著將表面修飾有SA的鐵卟啉基金屬有機框架（FeTCPP@MOF-SA）引入到電極表面，借助于FeTCPP對鄰苯二胺的仿生催化作用，使得檢測靈敏度獲得了顯著提高。Zheng等[21]將核酸適配體分子通過金-硫鍵自組裝的方式固定在沉積有金納米粒子（AuNPs）的GCE表面，待適配體與循環腫瘤細胞（CTCs）發生特異性識別后，進一步將表面修飾有適配體分子的Fe3O4@Ag-Pd雜合納米粒子引入到電極表面，借助于雜合納米粒子對硫堇分子的電催化活性，實現了CTCs的高靈敏電化學檢測［圖2(c)］。不過，與天然酶相比，仿生催化劑和納米材料尚存在催化效率低、選擇性差等缺陷[22]。

基于納米材料的信號放大策略，主要是通過將納米材料引入到檢測體系中，由于它們具有較大的比表面積，可以負載大量的信號探針，從而有效地提高檢測靈敏度[23]。例如，Wang等[24]借助于AuNPs的信號放大作用，實現了蛋白激酶A（PKA）活性的高靈敏電化學檢測，檢測下限為30mU/mL［圖2(d)］。在該方法中，研究人員首先將底物肽通過自組裝的方式固定在金電極表面，待PKA將底物肽在特定位點進行磷酸化而引入磷酸基團后，通過Zr(Ⅳ)的配位鍵合作用將表面修飾有大量ssDNA片段的AuNPs引入到電極表面，并進一步借助于DNA雜交反應在電極表面形成由ssDNA片段功能化的AuNPs所組成的網絡結構，使得大量的電活性[Ru(NH3)6]3+探針能通過靜電相互作用的方式被富集到電極表面，從而實現對PKA活性的高靈敏檢測。基于納米材料的信號放大策略，盡管能有效地提高生物傳感器的檢測靈敏度，但是納米材料的合成及其表面功能化的過程存在操作復雜等不足。

3 基于聚合物的信號放大策略

近年來，為提高生物傳感器的檢測靈敏度，已有多種基于聚合物的信號放大策略被報道[25-26]。聚合物鏈一般由成千上萬個單體構成，通過使用聚合物，因而可以在傳感器表面引入大量的信號探針［如二茂鐵（Fc）等］或者大量可用于修飾信號探針的官能團（如氨基、羧基、醛基等），從而實現對檢測信號進行放大的目的。基于聚合物的信號放大策略主要包括直接法和間接法兩種途徑。直接法是指直接使用現成的聚合物來對檢測信號進行放大。例如，Gibbs等[25]將作為捕獲探針的ssDNA片段通過自組裝的方式固定在金電極表面，待其與靶ssDNA雜交后，將一端偶聯有多條ssDNA片段另一端修飾有大量Fc探針的共聚合物通過“夾心型”雜交反應的方式標記到電極表面，用于對靶ssDNA濃度進行高靈敏電化學檢測，檢測下限為0.1nmol/L。Hu等[26]以骨架呈電中性的肽核酸（PNA）分子作為固定化捕獲探針，待其與靶ssDNA雜交后，通過Zr(Ⅳ)的配位鍵合作用將多聚半乳糖醛酸（PGUA）分子修飾到被捕獲的ssDNA上，然后用NaIO4將PGUA分子骨架里的鄰位羥基氧化成醛基，生成的醛基進一步將Ag+還原成銀納米粒子（AgNPs）并原位沉積在電極表面，通過對沉積的AgNPs進行溶出分析，實現了ssDNA濃度的高靈敏電化學檢測，檢測下限低至2.5amol/L［圖3(a)］。此外，水溶性共軛聚合物由于具有顯著的熒光信號放大作用，在生物分子的高靈敏檢測中也獲得了大量的應用[27-28]。例如，Ho等[27]直接以陽離子聚噻吩作為傳感元件，借助于陽離子聚噻吩與ssDNA或雙鏈DNA（dsDNA）片段發生靜電結合時會具有不同的構象且聚噻吩/dsDNA復合物與鄰近的偶聯在ssDNA探針末端上的熒光團之間存在高效、快速的能量轉移的現象，實現了核酸的高靈敏檢測，檢測下限低至3.0zmol/L。直接使用現成的聚合物來對檢測信號進行放大，具有操作簡便等優勢。不過，在非均相檢測體系中（如電極等固體基底表面），由于聚合物鏈從溶液中擴散到特定結合位點并與之結合的過程需要經歷構象變化并克服位阻障礙，使得標記過程存在效率低下以及負載量低等問題[29]。

為克服上述缺陷，可以通過原位從頭合成聚合物的途徑來進行信號放大，即間接法。在聚合過程中，大量單體分子聚集形成長鏈聚合物，聚合物的側鏈可以包含大量的信號探針或者大量可供后續修飾信號探針的官能團，從而顯著提高信號探針的負載量，實現對生物分子的高靈敏檢測。例如，以脫氧核糖核苷酸（A、T、G、C）為單體，借助于滾環擴增（RCA）[30]或末端脫氧核苷酸轉移酶［TdT，如圖3(b)所示］[31]原位延伸獲得較長的ssDNA片段，然后通過靜電相互作用等方式引入大量的信號探針（如[Ru(NH3)6]3+等），即可實現對核酸等生物分子的高靈敏檢測；不過，延伸反應需要在酶（如phi29 DNA聚合酶或TdT等）的催化下才能進行，導致存在成本高昂等問題。類似地，直接以發卡ssDNA片段作為單體，借助于雜交鏈反應（HCR）[32]或雙核酸催化組裝技術（CHA）[33]，也可以原位延伸獲得較長的dsDNA片段，并進一步通過靜電相互作用等方式引入大量的[Ru(NH3)6]3+等探針，從而實現對生物分子的高靈敏檢測；然而，以發卡ssDNA片段作為單體，存在成本高昂和雜交反應效率低下等問題。

4 可控/“活性”自由基聚合技術概述

圖3 基于直接使用現成聚合物[26]和原位形成聚合物[31]的信號放大策略

自由基聚合（又稱游離基聚合，RP）指由自由基引發，使鏈增長自由基持續增長的聚合反應，包含鏈引發、鏈增長、鏈終止和鏈轉移4種基元反應。在傳統RP體系中，由于自由基濃度較高，容易發生自由基-自由基終止反應，導致聚合反應不可控，使得聚合產物存在分子量分布寬以及結構難以控制等缺陷。可控/“活性”自由基聚合（CLRP）是通過在聚合反應體系中加入特定組分，其能與鏈增長自由基（活性種）進行可逆的鏈轉移或鏈終止反應，使活性種失活轉變成無增長活性的休眠種，該休眠種又可重新分裂成活性種，從而建立活性種與休眠種的快速動態平衡，使得體系中的自由基濃度保持在很低的水平（約10nmol/L），從而抑制自由基-自由基終止反應，達到可控/“活性”的目的[34]。主要的CLRP技術包括穩定自由基聚合（stable free radical polymerization，SFRP）、原子轉移自由基聚合（atom transfer radical polymerization，ATRP）以及可逆加成-斷裂鏈轉移（reversible addition-fragmentation chain transfer，RAFT）聚合等。

SFRP是通過在聚合體系中加入TEMPO（2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧自由基）或Co(Ⅱ)等穩定自由基來達到可控/“活性”的目的[35]。TEMPO屬于穩定的有機自由基，基于TEMPO的SFRP體系具有工藝簡單等優點。不過，TEMPO價格昂貴、合成困難；此外，該體系只適用于苯乙烯及其衍生物的聚合，且存在聚合速率低以及需要在高溫（110～140℃）下進行等缺陷[36]。·Co(Ⅱ)屬于穩定的有機金屬自由基，主要用于丙烯酸酯的聚合，合成的聚合物存在分子量低、分子量分布較寬等不足[36]。

ATRP是由卡內基-梅隆大學的Matyjaszewski課題組[37]在1995年首次提出的一種CLRP技術，通過基于內層電子轉移（ISET）的協調原子轉移機制進行[38]。ATRP以有機鹵化物為引發劑，在過渡金屬（如CuI/CuII）絡合物的作用下實現鹵原子（如Br等）在活性種和休眠種之間的可逆轉移，以保持自由基濃度在很低的水平，從而使得聚合反應得到有效的控制[37]。根據引發方式的不同，可分為常規ATRP、反向ATRP、電子轉移產生活化劑ATRP（AGET ATRP）、電子轉移再生活化劑ATRP（ARGET ATRP）、引發劑連續再生活化劑ATRP（ICAR ATRP）、補充活化劑和還原劑ATRP（SARA ATRP）、電化學調控ATRP（eATRP）、光誘導ATRP（photoATRP）等多種類型[39]。由于具有適用單體范圍寬［如（甲基）丙烯酸酯、丙烯腈、苯乙烯、（甲基）丙烯酰胺等］、聚合產物分子量分布窄、反應條件溫和以及分子設計能力強等優良特性[39]，ATRP已經在材料合成[40]和表面功能化[41]等領域獲得了大量的應用。不過，由于ATRP反應過程中需要使用過渡金屬（如CuI/CuII）絡合物作為活化劑和鈍化劑，因而存在過渡金屬殘留等問題。

RAFT聚合是1998年由澳大利亞的CSIRO團隊報道了一種CLRP技術[42]。不同于ATRP，RAFT聚合是在反應體系中加入硫代羰基硫化物（如黃原酸鹽、二硫代苯甲酸酯、三硫代碳酸酯等）作為鏈轉移劑（CTAs，也叫RAFT試劑），通過加入的CTAs與初級自由基（由引發自由基與單體反應生成）發生鏈轉移生成增殖自由基，隨后建立增殖自由基與CTAs之間的可逆加成-斷裂平衡，實現控制聚合體系中增長自由基的濃度，達到可控/“活性”的目的[42-44]。CTAs的一般結構為S＝C(Z)S－R。其中，R為自由基離去基團，能夠重新引發自由基聚合；Z基團則控制著C＝S的反應活性，對自由基的加成和斷裂反應速率具有很大的影響。RAFT聚合除具有ATRP等CLRP技術的一般特征（如聚合產物的分子量可控等）之外，還具有：①適用單體范圍廣［除（甲基）丙烯酸酯、（甲基）丙烯酰胺和丙烯腈等單體外，丙烯酸等酸、堿性單體或質子性單體均可聚合］；②對于工業生產而言反應條件溫和；③可用于溶液、本體、懸浮、乳液等不同聚合體系；④可以借助于活性末端引入特定功能基團，并可合成嵌段、星型等具有精細拓撲結構的聚合物等優良特性[43-44]。尤其重要的是，RAFT聚合不需要使用過渡金屬絡合物作為活化劑和鈍化劑，因而具有較好的生物相容性，而且不會存在過渡金屬殘留等問題。不過，由于存在自由基-自由基終止等不可逆終止反應，在RAFT聚合過程中需要連續補充引發自由基，其在與單體反應生成初級自由基而引發自由基聚合的同時也會引起鏈終止反應。此外，硫代羰基硫化物的制備過程比較復雜，其存在可能使聚合物帶有一定的氣味和顏色。

5 基于CLRP的信號放大策略及生物傳感應用

為克服傳統信號放大策略所存在的成本高昂和操作復雜等不足，研究人員提出將ATRP和RAFT聚合等CLRP技術作為一類新型信號放大策略，以烯類小分子為單體，通過原位從頭合成聚合物，來對生物分子進行高靈敏檢測[36,45-47]。

5.1 基于ATRP的高靈敏生物傳感

近年來，基于ATRP的信號放大策略，在蛋白質和核酸等生物分子的高靈敏檢測中已經獲得了一定的應用[36,45]。例如，Lou等[48]以ssDNA片段作為捕獲探針，待其與靶ssDNA雜交后，將末端修飾有ATRP引發劑的ssDNA片段通過“夾心型”雜交反應引入到基底表面，以甲基丙烯酸羥乙基酯（HEMA）作為單體，在基底表面原位從頭合成聚合物，通過觀察基底透光性的改變，對靶ssDNA濃度進行可視化檢測，檢測下限為1.0nmol/L。類似地，Qian等[49]和Xu等[50]借助于AGET ATRP的信號放大作用，通過觀察基底表面原位形成的聚合物斑點，分別實現了對卵清蛋白和免疫球蛋白G（IgG）的高靈敏可視化檢測。在沒有任何檢測設備協助的情況下，含量極低的靶生物分子（如飛摩爾量級別的靶ssDNA[48]或皮摩爾量級別的卵清蛋白[49]）仍可被清晰辨別；因此，基于ATRP的可視化檢測方法具有操作簡便、成本低廉等優良特性，具有很好的實用性。Wu等[51]借助于AGET ATRP的信號放大作用，構建了一種電致化學發光（ECL）免疫傳感器，實現了對癌胚抗原（CEA）濃度的高靈敏檢測，檢測下限低至0.5pg/mL。Hu等以PNA作為捕獲探針，以甲基丙烯酸二茂鐵基甲酯（FcMMA）作為單體，借助于eATRP的信號放大作用，對ssDNA[52]和dsDNA濃度[53]進行高靈敏電化學檢測，檢測下限分別為0.072fmol/L和0.47fmol/L。此外，Hu等[54]將底物肽通過自組裝的方式固定在金電極表面，待PKA將底物肽在特定位點進行磷酸化而引入磷酸基團后，通過Zr(Ⅳ)的配位鍵合作用將溴苯乙酸（BPAA）連接到電極表面作為引發劑，以FcMMA作為單體在電極表面進行eATRP反應，原位從頭生成大量的含Fc的電活性聚合物，實現了PKA活性的高靈敏電化學檢測，檢測下限為1.63mU/mL。最近，Hu等[55]進一步借助于基于eATRP的信號放大策略，實現了胰蛋白酶活性的高靈敏電化學檢測［圖4(a)］，檢測下限為0.016mU/mL（約2.68pmol/L或0.064ng/mL)。基于ATRP的信號放大策略，憑借其所具備的操作簡便、成本低廉和高效等優良特性，在蛋白質和核酸等生物分子的高靈敏檢測中具有廣闊的應用前景。不過，在進行ATRP的過程中，需要使用到Cu(Ⅰ)/L和Cu(Ⅱ)/L（L為配體）分別作為活化劑和鈍化劑，具有一定的生物毒性，限制了其在生物醫學等領域中的應用潛能，而且殘留的過渡金屬可能會對后續的電化學檢測存在干擾[56-57]。

5.2 基于RAFT聚合的高靈敏生物傳感

圖4 基于eATRP的胰蛋白酶活性檢測和基于eRAFT聚合的PKA活性檢測[55,62]

RAFT聚合由于不需要使用過渡金屬絡合物作為活化劑和鈍化劑，因而具有較好的生物相容性，而且不會存在過渡金屬殘留等問題。為克服基于ATRP的信號放大策略所存在的過渡金屬殘留等缺陷，He等[56]將RAFT聚合用作一種信號放大策略，借助于RAFT聚合在基底表面從頭合成聚合物，對ssDNA濃度進行可視化檢測，檢測下限為1.0fmol/L。在沒有使用任何檢測設備的情況下，含量為2000拷貝的靶ssDNA仍可被清晰地檢測到。類似地，He等[46]借助于RAFT聚合的信號放大作用，通過觀察基底表面原位形成的聚合物斑點，對人X和Y染色體DNA進行可視化檢測，其檢測結果與基于聚合酶鏈式反應（PCR）的檢測方法相當。Hu等借助于RAFT聚合的信號放大作用，實現了ssDNA濃度[57]、PKA活性[58]以及凝血酶活性[59]的高靈敏電化學檢測，檢測下限分別為3.2amol/L、1.05mU/mL和2.7μU/mL。基于RAFT聚合的信號放大策略，同樣具有操作簡便、成本低廉和高效等優良特性。不過，由于存在自由基-自由基終止等不可逆終止反應，在RAFT聚合過程中需要連續補充引發自由基。通常情況下，引發自由基可以通過熱分解（＞50℃）偶氮二異丁腈（AIBN）等自由基引發劑產生。然而，如此高的熱引發溫度，可能會引起生物分子變性失活。此外，以一種常用的水溶性鏈轉移劑4-氰基-4-(硫代苯甲酰)戊酸（CPAD）為例，經過24h，其在50℃下可被分解約36%，在60℃下可被分解約84%，在70℃下可被分解高達約90%[60]。因此，在相對溫和的條件下進行RAFT聚合，對生物傳感等領域來說十分必要。為此，Hu等建立了一種基于電化學調控RAFT（eRAFT）聚合的信號放大策略，實現了對ssDNA濃度[61]和PKA活性［圖4(b)］[62]的高靈敏電化學檢測，檢測下限分別為4.1×10-18mol/L和1.02mU/mL。在eRAFT聚合中，引發自由基是在常溫下通過電化學還原芳基重氮鹽等化合物產生[63]。與傳統熱引發等方式相比，利用電化學手段引發和調控RAFT聚合，具有反應條件溫和、生物相容性好等優良特性。而且，僅通過調節電位或電流等參數，就可以實現對聚合反應過程進行精確的調控。憑借其所具有的操作簡便、成本低廉、高效和反應條件溫和等優良特性，基于eRAFT聚合的信號放大策略在生物分子的高靈敏檢測等方面必將具有廣闊的應用前景。

6 結語

蛋白質和核酸等生物分子的簡便、快速、低成本、高靈敏和高選擇性檢測，一直是生物傳感等領域的一個重要的研究熱點，在惡性腫瘤等重大疾病的早期診斷等諸多領域具有廣闊的應用前景。為克服傳統信號放大策略所存在的成本高昂和操作復雜等不足，近年來，研究人員探索建立了一類基于ATRP和RAFT聚合等CLRP技術的新型信號放大策略，通過在基底表面原位生成大量的聚合物，實現了對蛋白質和核酸等生物分子的高靈敏檢測。基于CLRP的信號放大策略，具有操作簡便、成本低廉和高效等優良特性，在生物分子的高靈敏檢測中具有相當廣闊的應用前景。

然而，圍繞基于CLRP的信號放大策略的研究工作尚處于初步階段，在聚合物固-液界面生長動力學與調控、聚合物表面接枝量對界面電荷轉移動力學的影響規律以及分子識別元件組裝密度等因素對聚合反應動力學的影響規律等方面的研究還有待進一步深入，以期為基于CLRP的信號放大策略的廣泛應用提供堅實的理論支撐與技術保障。