肺炎克雷伯菌胞外多糖抗生物膜活性研究

劉姝靈， 稅 劍， 馬小華， 潘建華， 石國民， 喻 容， 周前選， 龍江文， 易一行， 向延根

細菌生物膜（biofilm）是指細菌為適應(yīng)周圍復(fù)雜環(huán)境，黏附于接觸介質(zhì)表面、生長繁殖并分泌大量胞外基質(zhì)（蛋白質(zhì)、胞外多糖、DNA、脂質(zhì)等），將其自身緊緊包裹形成致密的、三維立體結(jié)構(gòu)的膜狀聚合物。自然界中大多數(shù)細菌能以生物膜形式生長，相對于浮游態(tài)細菌，處于生物膜狀態(tài)細菌代謝活性低、生長速度慢，容易對抗菌藥物產(chǎn)生耐藥性，同時生物膜構(gòu)成滲透屏障阻礙抗菌藥物滲透、逃避機體免疫攻擊[1-2]。細菌形成生物膜后會導(dǎo)致耐藥性升高，大量研究證實生物膜可使細菌耐藥性提高10～1000倍[3]。有研究報道臨床上超過65%慢性感染與生物膜密切相關(guān)[4-5]。如何有效防治細菌生物膜形成所引起的慢性感染成為亟待解決的公共衛(wèi)生問題。目前，細菌多糖由于其廣譜抗生物膜效果、無殺菌作用等優(yōu)點而受到了廣泛關(guān)注[6-7]。肺炎克雷伯菌是臨床常見的條件致病菌，對環(huán)境適應(yīng)能力強，可以充分利用各種營養(yǎng)成分，產(chǎn)生多種次級代謝產(chǎn)物，其中代謝產(chǎn)生的大量胞外多糖是否具有抗生物膜活性需要進一步探索。本研究以具有強成膜能力的表皮葡萄球菌ATCC 35984為模式菌株，探索肺炎克雷伯菌上清液的抗生物膜活性并鑒定該活性物質(zhì)的化學(xué)性質(zhì)；采用粗提多糖探討不同濃度肺炎克雷伯菌胞外多糖對生物膜活性的影響；研究肺炎克雷伯菌多糖的廣譜抗生物膜活性，以期尋找到一種新的具備抗生物膜功能的細菌胞外多糖，為臨床生物膜相關(guān)性感染的有效防治提供一種新的廣譜、安全、高效、低耐藥性的治療手段。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 收集2019—2020年南華大學(xué)附屬長沙中心醫(yī)院住院患者臨床分離的肺炎克雷伯菌20株，成膜能力較強的大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌、表皮葡萄球菌、金黃色葡萄球菌臨床分離菌各2株，生物膜模式菌株為表皮葡萄球菌ATCC 35984、銅綠假單胞菌PAO1。菌株鑒定使用VITEK 2-Compact 全自動微生物分析系統(tǒng)。

1.1.2 儀器與試劑 LB肉湯購于上海生工生物工程股份有限公司，TSB肉湯、無水乙醇、無水葡萄糖、結(jié)晶紫、蛋白酶K、DNA酶I、RNA酶A購于北京索萊寶公司，96孔板購于NEST/無錫耐思生物科技有限公司，0.22 μm濾菌器購于美國Millipore 公司，高碘酸鈉購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司，苯酚購于衡陽市江東化學(xué)試劑廠，98%濃硫酸購于株洲市星空化玻有限公司，細菌比濁儀購于法國梅里埃公司，酶標儀購于深圳市匯松科技發(fā)展有限公司，恒溫搖床購于金壇市榮華儀器制造有限公司，VITEK 2-Compact全自動微生物分析系統(tǒng)購于法國梅里埃公司。

1.2 方法

1.2.1 抗表皮葡萄球菌生物膜的肺炎克雷伯菌菌株篩選

1.2.1.1 肺炎克雷伯菌培養(yǎng)上清液制備 采用參考文獻中的方法[8-9]，將收集的20株肺炎克雷伯菌臨床菌株轉(zhuǎn)種于哥倫比亞血平板，取3～5個菌落用LB肉湯調(diào)整菌液濃度為2.0麥氏單位，取20 mL菌液于37℃、200 r/min條件下振蕩培養(yǎng)48 h，隨后4℃、4 000 r/min離心30 min，0.22 μm濾菌器過濾備用。

1.2.1.2 抗表皮葡萄球菌生物膜活性試驗 挑取表皮葡萄球菌ATCC 35984單個菌落于TSB肉湯中37℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，調(diào)整菌液濃度為0.5麥氏單位。將96孔板分為實驗組和對照組，吸取100 μL菌液加入到96孔細胞培養(yǎng)板，隨后分別加肺炎克雷伯菌上清液100 μL或同等體積生理鹽水于實驗組和對照組中。所有組別均設(shè)置3個復(fù)孔，充分混勻，膠帶封板，37℃培養(yǎng)16 h。棄去培養(yǎng)菌液并用生理鹽水洗滌3遍，37℃晾干，0.1%結(jié)晶紫染色15 min，生理鹽水洗滌以去除未結(jié)合染液，37℃晾干，95%乙醇溶解20 min后測定其570 nm處的吸光度（D570）值。

1.2.1.3 生物膜抑制率計算 生物膜抑制率=（對照組吸光度均值-實驗組吸光度均值）/對照組吸光度均值×100%。

1.2.2 肺炎克雷伯菌上清液中抗生物膜活性物質(zhì)的化學(xué)性質(zhì)分析 以對表皮葡萄球菌ATCC 35984生物膜抑制率為73.5%肺炎克雷伯菌上清液作為研究對象進行下一步化學(xué)性質(zhì)分析。

1.2.2.1 待測樣本制備 ①煮沸法：肺炎克雷伯菌上清液37℃溫育1 h，100℃煮沸30 min，4℃保存?zhèn)溆谩＂诿柑幚矸ǎ簩? g/L蛋白酶K、DNA酶I、RNA酶A分別與肺炎克雷伯菌上清液充分混勻使蛋白酶K、DNA酶I、RNA酶A濃度分別為100、100、80 mg/L，37℃溫育1 h，100℃煮沸30 min，4℃保存?zhèn)溆谩＂鄹叩馑徕c法：將30 mmol/L高碘酸鈉100 μL與900 μL上清液充分混勻，避光37℃溫育1 h，100℃煮沸 30 min，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.2 抗生物膜活性物質(zhì)的化學(xué)性質(zhì)分析 取處理后的肺炎克雷伯菌上清液參照1.2.1.2所述方法進行抗表皮葡萄球菌ATCC 35984生物膜活性試驗，探討高溫、酶、高碘酸鈉對肺炎克雷伯菌上清液中的活性物質(zhì)的影響，并分析該活性物質(zhì)的化學(xué)性質(zhì)。

1.2.3 肺炎克雷伯菌胞外多糖抗生物膜活性濃度依賴性測定

1.2.3.1 制定葡萄糖標準曲線 分別配制 250 mg/L葡萄糖標準溶液和5%苯酚溶液，并按表1順序依次加入試劑。每組各取200 μL溶液于96孔板中，490 nm處測定其吸光度值，制定葡萄糖標準曲線。

表1 葡萄糖標準曲線試劑Table 1 Reagents for glucose standard curve（mL）

1.2.3.2 肺炎克雷伯菌胞外多糖的提取 將上清液與無水乙醇充分混勻，調(diào)整無水乙醇終濃度為75%，4℃靜置過夜，4 000 r/min離心30 min棄上清液，晾干后得到粗提多糖沉淀，加入無菌蒸餾水2 mL使多糖沉淀充分溶解，根據(jù)葡萄糖標準曲線用硫酸苯酚法測定多糖溶液的濃度。

1.2.3.3 多糖抗生物膜活性的濃度依賴性 用無菌蒸餾水將多糖濃度調(diào)整為5%、10%、20%、30%、40%、50%，取不同濃度多糖各100 μL加入至96孔板中，用TSB肉湯調(diào)整表皮葡萄球菌菌液濃度為0.5麥氏單位。按照1.2.1.2所述方法進行肺炎克雷伯菌胞外多糖抗生物膜活性的濃度依賴性測定。

1.2.4 多糖對表皮葡萄球菌生長的影響 調(diào)整0.5麥氏單位濃度表皮葡萄球菌菌液12 mL，實驗組和對照組各取6 mL菌液于無菌試管中，隨后分別加肺炎克雷伯菌胞外多糖3 mL和同等體積的生理鹽水。充分混勻后置于37℃、200 r/min恒溫搖床中振蕩培養(yǎng)，間隔2 h分別取200 μL菌液測量實驗組和對照組600 nm處的吸光度，觀察24 h內(nèi)多糖對表皮葡萄球菌生長是否有影響。

1.2.5 肺炎克雷伯菌胞外多糖廣譜抗生物膜活性 收集具有較強成膜能力的大腸埃希菌、鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌、表皮葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、糞腸球菌等臨床菌株，并將菌液濃度調(diào)整為0.5麥氏單位，取肺炎克雷伯菌胞外多糖參照1.2.1.2所述方法進行抗生物膜活性實驗，鮑曼不動桿菌生物膜培養(yǎng)48 h，其余菌株生物膜培養(yǎng)16 h。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 用GraphPad Prism8軟件進行數(shù)據(jù)分析。所有實驗數(shù)據(jù)重復(fù)三次取平均值，實驗組與對照組抗生物膜活性差異比較采用配對t檢驗，以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 抗表皮葡萄球菌活性菌株的篩選

篩選了20株對表皮葡萄球菌ATCC 35984生物膜具有抑制作用的肺炎克雷伯菌臨床菌株，抑制率在16.1%～73.5%，肺炎克雷伯菌上清液對表皮葡萄球菌ATCC 35984生物膜的抑制作用見圖1。

圖1 肺炎克雷伯菌上清液對表皮葡萄球菌ATCC 35984生物膜的抑制作用Figure 1 Inhibition of the supernatant of each Klebsiella pneumoniae strain on the biofilm formation of Staphylococcus epidermidis ATCC 35984

2.2 肺炎克雷伯菌上清液中抗生物膜活性物質(zhì)的化學(xué)性質(zhì)分析

分別用高溫、蛋白酶K、DNA酶I、RNA酶A處理肺炎克雷伯菌上清液，并用處理后的肺炎克雷伯菌上清液進行抗表皮葡萄球菌生物膜活性試驗，所得吸光度均值分別為0.816 0±0.045 2、0.781 2±0.043 6、0.776 3±0.026 4、0.781 1±0.006 6，與對照組吸光度均值2.806 0±0.027 0比較，差異均有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），研究表明高溫、蛋白酶、核酸酶無法使肺炎克雷伯菌上清液中抗表皮葡萄球菌生物膜活性物質(zhì)失去活性，表明肺炎克雷伯菌上清液中含有的抗生物膜活性物質(zhì)不屬于蛋白質(zhì)、核酸類物質(zhì)。為了證實此抗生物膜活性是否由糖類引起，本研究采用30 mmol/L高碘酸鈉處理上清液，吸光度均值為2.814 5±0.012 0，與對照組2.806 0±0.027 0比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。高碘酸鈉作為一種氧化劑，可以選擇性斷裂分子中聯(lián)二羥基或聯(lián)三羥基處，生成相應(yīng)的多糖醛、甲醛和甲酸，由此說明肺炎克雷伯菌上清液中的抗生物膜活性成分是一種多糖。肺炎克雷伯菌上清液中抗生物膜活性物質(zhì)化學(xué)性質(zhì)分析見圖2。

圖2 肺炎克雷伯菌上清液中抗生物膜活性物質(zhì)化學(xué)性質(zhì)分析Figure 2 Characterization of the chemical properties of the active anti-biofilm substances in Klebsiella pneumoniae supernatant

2.3 肺炎克雷伯菌胞外多糖抗生物膜活性的濃度依賴性

采用硫酸苯酚法制定葡萄糖標準曲線y=0.010 1x+ 0.193 3（R2= 0.997 9，P＜0.01），將待測多糖的吸光度D490代入葡萄糖標準曲線測得肺炎克雷伯菌粗提多糖含量為200.1 mg/L。肺炎克雷伯菌胞外多糖對表皮葡萄球菌生物膜的抑制作用具有濃度依賴性，5%、10%、20%、30%、40%、50%多糖可使表皮葡萄球菌生物膜量由2.778 1±0.040 0，分別減少至2.730 7±0.031 2（P＞0.05）、2.689 7±0.028 5（P＞0.05）、2.511 9±0.043 0（P＜0.05）、1.131 0±0.053 5（P＜0.01）、0.609 7±0.045 3（P＜0.01）、0.609 3±0.026 2（P＜0.01）。不同濃度肺炎克雷伯菌胞外多糖對表皮葡萄球菌生物膜抑制活性見圖3。

2.4 肺炎克雷伯菌胞外多糖對表皮葡萄球菌ATCC 35984生長的影響

在開始4 h內(nèi)，多糖組與對照組細菌均處于延滯期，隨著培養(yǎng)時間延長，兩組細菌開始生長，到達16 h后兩組細菌進入穩(wěn)定期。研究發(fā)現(xiàn)肺炎克雷伯菌胞外粗提多糖對表皮葡萄球菌ATCC 35984的生長不具有抑制作用。兩組細菌的生長曲線見圖4。

圖3 不同濃度多糖對表皮葡萄球菌生物膜影響Figure 3 Effects of different concentrations of polysaccharides on Staphylococcus epidermidis biofilm formation

圖4 肺炎克雷伯菌上清液對表皮葡萄球菌生長的影響Figure 4 The effect of Klebsiella pneumoniae supernatant on the growth of Staphylococcus epidermidis

2.5 肺炎克雷伯菌胞外多糖廣譜抗生物膜活性

肺炎克雷伯菌胞外多糖對銅綠假單胞菌PAO1、銅綠假單胞菌15、銅綠假單胞菌16、大腸埃希菌06、大腸埃希菌39、鮑曼不動桿菌02、鮑曼不動桿菌10、糞腸球菌05、糞腸球菌18、表皮葡萄球菌06、表皮葡萄球菌13、表皮葡萄球菌ATCC 35984、金黃色葡萄球菌11、金黃色葡萄球菌23生物膜抑制率分別為40.3%、15.1%、13.0%、28.2%、33.3%、62.5%、64.7%、77.1%、88.9%、69.4%、72.9%、75.5%、85.9%、87.4%。肺炎克雷伯菌胞外多糖廣譜抗生物膜活性見圖5。

3 討論

細菌生物膜是臨床進行侵襲性診療操作常見的感染原因之一。常見的生物膜細菌感染有銅綠假單胞菌生物膜引起的慢性骨髓炎、金黃色葡萄球菌生物膜引起的導(dǎo)管相關(guān)血流感染、大腸埃希菌生物膜引起的泌尿生殖道感染等[10]。生物膜細菌引起的感染通常有耐藥性強、反復(fù)發(fā)作等特點，這與生物膜的特殊結(jié)構(gòu)有關(guān)：①生物膜特殊的三維結(jié)構(gòu)導(dǎo)致藥物無法滲透和擴散，生物膜內(nèi)eDNA、胞外多糖等成分將抗菌藥物等殺菌物質(zhì)與細菌有效隔離；②生物膜內(nèi)部細菌代謝活性低，且其基因易發(fā)生轉(zhuǎn)移和突變，導(dǎo)致對藥物敏感性降低；③生物膜群體感應(yīng)系統(tǒng)使生物膜細菌對不利因素的適應(yīng)性增強[11]。雖然上述特點導(dǎo)致生物膜細菌難以清除，但是近年來有研究報道某些細菌的代謝產(chǎn)物具有抗生物膜活性作用。2006年Valle等[12]研究發(fā)現(xiàn)大腸埃希菌CFT073的Ⅱ型莢膜多糖能夠抑制大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、葡萄球菌和腸球菌生物膜的形成。此后的研究發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌、放線菌、益生菌的胞外產(chǎn)物對生物膜形成均具有一定的抑制作用，經(jīng)鑒定此物質(zhì)為多糖、蛋白質(zhì)或短鏈脂肪酸[13-15]。肺炎克雷伯菌是實驗室分離的常見菌，并且其在培養(yǎng)基中純度較高。因此，本研究提出假設(shè)：肺炎克雷伯菌或其代謝產(chǎn)物存在著某些抗生物膜活性物質(zhì)，這些活性物質(zhì)能有效抑制其他細菌生物膜的形成。為了驗證上述假設(shè)，首先對分泌具有抗表皮葡萄球菌生物膜活性物質(zhì)的肺炎克雷伯菌菌株進行篩選，然后對活性較強的肺炎克雷伯菌胞外產(chǎn)物進行化學(xué)成分鑒定，最后對肺炎克雷伯菌胞外產(chǎn)物進行廣譜抗生物膜活性研究。

本研究發(fā)現(xiàn)肺炎克雷伯菌上清液具有抑制表皮葡萄球菌生物膜活性，抑制率在16.1%～73.5%。說明不同的肺炎克雷伯菌菌株之間表達的具有抗生物膜活性物質(zhì)的含量不同。為了明確肺炎克雷伯菌上清液中抗生物膜活性物質(zhì)的化學(xué)性質(zhì)，本研究采用高溫、酶法等處理上清液，發(fā)現(xiàn)該物質(zhì)仍然能抑制表皮葡萄球菌生物膜形成，說明該物質(zhì)不屬于蛋白質(zhì)、核酸類物質(zhì)。而經(jīng)30 mmol/L高碘酸鈉處理后，發(fā)現(xiàn)該活性物質(zhì)對表皮葡萄球菌生物膜抑制作用消失，說明該活性物質(zhì)為多糖。因為高碘酸鈉是一種強氧化劑，能選擇性氧化多糖中的鄰二羥基使多糖失活，進而對表皮葡萄球菌生物膜抑制作用消失。進一步采用無水乙醇粗提上清液中的多糖，發(fā)現(xiàn)多糖抑制生物膜形成具有濃度依賴性，與Jiang等[8]的研究結(jié)果相符。為了研究該多糖是否通過抑制細菌生長從而影響生物膜的形成，將多糖對表皮葡萄球菌生長的影響進行了研究，發(fā)現(xiàn)加入粗提多糖之后，表皮葡萄球菌生長并沒有出現(xiàn)抑制，反而具有輕微的促生長作用。說明肺炎克雷伯菌胞外多糖不是通過抑制細菌生長發(fā)揮抗生物膜作用，具體抗生物膜作用機制有待進一步研究。

圖5 肺炎克雷伯菌多糖的廣譜抗生物膜活性Figure 5 Broad-spectrum anti-biofilm activity of Klebsiella pneumoniae polysaccharide

研究發(fā)現(xiàn)肺炎克雷伯菌胞外多糖，對大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌、金黃色葡萄球菌、糞腸球菌均具有不同程度的抗生物膜活性，其中該多糖對陽性球菌生物膜的抑制效果更強，可能機制是：①多糖能競爭性抑制細菌表面的黏附因子，降低了細菌表面張力，細菌生物膜無法形成；②多糖下調(diào)毒力基因抑制其他細菌胞外聚合物（EPS）的產(chǎn)生，導(dǎo)致無法建立有序的生物膜結(jié)構(gòu)；③多糖抑制了群體感應(yīng)系統(tǒng)中某些信號因子的產(chǎn)生，限制了細菌-細菌相互交流，導(dǎo)致生物膜無法成熟[16]。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)一種具有廣譜抗細菌生物膜活性肺炎克雷伯菌胞外多糖，該多糖抑制生物膜的效果有濃度依賴性。本研究結(jié)果可為將來抗生物膜活性藥物研究提供實驗依據(jù)。