Toll樣受體2和相關炎癥因子在金黃色葡萄球菌致慢性骨髓炎中的作用

王馥香， 徐東克， 王成昆， 李 靜， 楊 杰

骨髓炎是由于創傷、局部缺血或異物的存在，引起大量細菌的侵襲所致的進行性炎癥反應[1-2]。抗菌治療和外科清創術是骨髓炎治療的主要方式[3]。但這些方式可能會延長患者住院時間，并且增加患者的醫療費用。盡管外科手術和藥物治療取得了相當大的進展，但骨髓炎的治療仍十分困難，臨床治療時需綜合考慮宿主因素和解剖因素，這對外科治療和藥物治療均提出了挑戰。本研究探究分析了Toll樣受體2（TLR2）和相關炎癥因子在金黃色葡萄球菌感染所致的慢性骨髓炎發展中的作用，為后期進一步探究骨髓炎的發病機制，并研發金黃色葡萄球菌所致慢性骨髓炎的針對性藥物提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 一般臨床資料

收集2015年5月—2019年7月，至南陽醫學高等專科學校第一附屬醫院治療的金黃色葡萄球菌感染所致慢性骨髓炎患者60例，作為研究組。同時收集60例健康體檢者，作為對照組。研究組患者年齡30～60歲，平均（45.5±5.5）歲。對照組年齡29～58歲，平均（46.2±4.5）歲。兩組入選者一般資料差異無統計學意義。納入標準：①年齡25～60歲；②患者均表現局部疼痛、紅腫和竇道形成，并經X線攝片診斷為慢性骨髓炎，并取傷口分泌物進行致病菌培養和鑒定，確診為金黃色葡萄球菌感染；③無其他重大疾病；④意識清晰，自主簽署知情同意書。排除標準：①急性/亞急性骨髓炎；②患有其他重大疾病；③臨床數據不全或治療后失聯；④無法自主簽署知情同意書。

小鼠MC3T3-E1細胞購自上海中科院細胞庫。標準菌株金黃色葡萄球菌ATCC 25923由本院檢驗科提供。

1.2 方法

1.2.1 ELISA法檢測蛋白表達水平 使用人TLR2檢測試劑盒（上海信裕生物科技有限公司，中國）檢測受檢者血清和細胞上清液中的TLR2水平。使用人白細胞介素-6（IL-6）檢測試劑盒（北京方程生物，中國）檢測受檢者血清和細胞上清液中的IL-6水平。使用人腫瘤壞死因子-α（TNF-α）檢測試劑盒（北京方程生物，中國）檢測受檢者血清和細胞上清液中的TNF-α水平。

1.2.2 Western blot檢測蛋白表達水平 進行10%的SDS-PAGE電泳，轉膜后使用5%脫脂奶粉-PBS孵育PVDF膜1.5 h，然后使用相應一抗于4℃孵育過夜，次日使用對應二抗孵育1 h，然后使用超敏ECL化學發光試劑盒（碧云天，中國）顯影。

1.2.3 RT-PCR法檢測mRNA水平 采用Trizol法提取細胞總RNA，使用一步法RT-PCR試劑盒（上海聯邁生物工程有限公司，中國）進行RTPCR檢測TLR2 mRNA水平，所用正向引物為“5’-CACTGGGGGTAACATCGCTT-3’”,反 向 引物為“5’-GCTGACTTCACTACGGGCA-3’”。

1.2.4 流式細胞儀測定細胞凋亡 使用Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒（Invitrogen，USA）檢測細胞凋亡。使用流式細胞儀（FACSCalibur，BD Bioscience USA）對樣品進行凋亡測定，并使用Flowjo軟件分析各組細胞凋亡率。

2 結果

2.1 慢性骨髓炎患者血清TLR2表達和炎癥因子水平

比較研究組患者和對照組血清TLR2表達和炎癥因子IL-6和TNF-α水平。與健康體檢者相比，慢性骨髓炎患者血清TLR2、IL-6和TNF-α水平均顯著升高（P＜0.05）。見表1。

2.2 金黃色葡萄球菌感染促使細胞凋亡

使用80 MOI金黃色葡萄球菌感染小鼠MC3T3-E1細胞，在感染前（0 h）和感染后6 h、12 h、24 h、36 h和48 h檢測細胞凋亡情況，并設置未感染的小鼠MC3T3-E1細胞為未感染組。

表1 慢性骨髓炎患者血清TLR2表達和炎癥因子水平Table 1 Serum levels of TLR2 and inflammatory factors in patients with chronic osteomyelitis

流式細胞檢測結果顯示金黃色葡萄球菌感染顯著促使小鼠MC3T3-E1細胞凋亡，且與時間呈正相關。感染12 h時，感染組細胞凋亡比例 （19.5%）顯著高于未感染組（2.6%），P＜0.05，且在48 h時，感染組細胞凋亡比例達到50.5%，顯著高于未感染組（3.5%），P＜0.05。此外，金黃色葡萄球菌感染后，細胞促凋亡基因bax表達水平顯著升高，抗細胞凋亡基因bcl-2表達量顯著下降，且表現出時間依賴性，進一步證實了金黃色葡萄球菌對小鼠MC3T3-E1細胞凋亡的影響。見圖1。

圖1 金黃色葡萄球菌感染促使細胞凋亡Figure 1 Staphylococcus aureus infection promotes cell apoptosis

2.3 金黃色葡萄球菌感染時TLR2和炎癥因子的變化

分別檢測經80 MOI金黃色葡萄球菌感染前和 感 染 后6 h、12 h、24 h、36 h、48 h的 小 鼠MC3T3-E1細胞的TLR2 mRNA和蛋白表達水平，以及炎癥因子IL-6和TNF-α的表達。

金黃色葡萄球菌感染細胞后，顯著提高了TLR2 mRNA和蛋白表達水平（P＜0.05），見圖2，并促進了炎癥因子IL-6和TNF-α的表達（P＜0.05），見圖3。

2.4 抑制 TLR2 可降低金黃色葡萄球菌誘導的IL-6 和 TNF-α 表達

為探究TLR2在金黃色葡萄球菌感染中所起的作用，實驗使用TLR2阻斷抗體孵育80 MOI金黃色葡萄球菌感染的小鼠MC3T3-E1細胞，并設置未處理組作為對照。處理24 h后，檢測細胞的TLR2 mRNA和蛋白表達水平，比較兩組細胞中的TLR2 表達水平變化。

經TLR2阻斷抗體處理的細胞中的TLR2 表達水平顯著低于未處理組（P＜0.05），見圖4。同時，發現IL-6 和 TNF-α表達水平也顯著低于未處理組（P＜0.05），見圖5。

圖2 金黃色葡萄球菌感染增強細胞TLR2 mRNA和蛋白的表達Figure 2 Staphylococcus aureus infection enhances the expression of TLR2 protein in cells*P < 0.05 compared with the baseline level before infection. TLR2, Toll-like receptor 2.

圖3 金黃色葡萄球菌感染促進TNF-α和IL-6的表達升高Figure 3 Staphylococcus aureus infection stimulates the expression of TNF-α and IL-6

圖4 TLR2阻斷抗體處理抑制金黃色葡萄球菌誘導的細胞TLR2 表達Figure 4 TLR2 blocking antibody treatment inhibits the expression of TLR2 induced by Staphylococcus aureus in cell experiments

圖5 抑制 TLR2 降低金黃色葡萄球菌誘導的IL-6 和 TNF-α表達Figure 5 Blocking TLR2 reduces the expression of IL-6 and TNF-α induced by Staphylococcus aureus

3 討論

慢性和復發性感染是臨床的嚴重問題，特別是骨組織的細菌感染,更傾向于演變成慢性病，增加治療難度[4]。根據細菌感染骨組織的途徑，可以將不同類型的骨髓炎進行分類，例如血腫性骨髓炎，這是由于創傷后局部感染的持續蔓延或足部潰瘍引起的[5]。所有不同類型的骨髓炎均可發展為慢性和復發性病程，在感染后數周至數月仍有癥狀。金黃色葡萄球菌是臨床骨髓炎中最常見的致病菌之一。本研究發現在金黃色葡萄球菌所致慢性骨髓炎中，患者血清TLR2水平和炎癥因子（IL-6、TNF-α）水平均顯著升高。

為了進一步探究TLR2所起的作用，研究使用金黃色葡萄球菌感染小鼠MC3T3-E1細胞，發現金黃色葡萄球菌感染對小鼠MC3T3-E1細胞凋亡的誘導作用顯著，并顯著提高了TLR2 mRNA和蛋白表達水平,促進了炎癥因子IL-6和TNF-α的表達。

TLR信號傳導是啟動針對人類和動物中入侵微生物的宿主免疫防御機制的研究最充分的途徑之一[6]。TLR是先天性和適應性免疫的重要介質，可對多種微生物配體和宿主在感染過程中產生的“危險信號”做出反應[7-8]。已有的研究數據表明，表達的TLR具有誘導細胞炎癥因子和趨化因子的產生，或激活下游信號轉導（NF-kB、p38和ERK）的功能[9-10]。本研究為證實在金黃色葡萄球菌感染中TLR2對炎癥因子IL-6和TNF-α的調控作用，采用了TLR2阻斷抗體處理感染后的細胞，結果發現TLR2 蛋白的減少顯著降低了IL-6和TNF-α的表達。

綜上所述，本課題探究了TLR2在金黃色葡萄球菌所致骨髓炎發展中所起的作用，證實在金黃色葡萄球菌所致的慢性骨髓炎患者中血清TLR2、IL-6和TNF-α水平都顯著升高，同時在細胞實驗中證實TLR2在誘導細胞凋亡中起的作用，并在這一過程中TLR2的表達調控細胞炎癥因子IL-6和TNF-α的表達，且呈正反饋作用，為進一步探究骨髓炎的發病機制，研發針對性藥物提供了理論基礎。