頭孢他啶-阿維巴坦對腸桿菌科細菌和銅綠假單胞菌的體外殺菌活性研究

孫 玥， 鄭永貴， 隗志翔， 楊 洋， 吳 湜， 郭 燕， 尹丹丹， 胡付品

頭孢他啶-阿維巴坦（ceftazidime-avibactam）是目前臨床治療碳青霉烯類耐藥腸桿菌科細菌（CRE）、銅綠假單胞菌所致感染的新型酶抑制劑合劑之一。其組分阿維巴坦是一種對A類、C類和部分D類β內酰胺酶具有抑制作用的新型β內酰胺酶抑制劑，能恢復頭孢他啶在治療產上述β內酰胺酶細菌所致感染時的抗菌活性。為觀察了解頭孢他啶-阿維巴坦在體外的殺菌作用，課題組進行了頭孢他啶-阿維巴坦對腸桿菌科細菌和銅綠假單胞菌臨床分離菌株的時間-殺菌曲線研究，現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 受試菌株 6株臨床菌株分別來源于復旦大學附屬華山醫院、上海交通大學附屬瑞金醫院、甘肅省人民醫院和哈爾濱醫科大學附屬第一醫院，均為已確定基因型與耐藥表型的保存菌株。其中，腸桿菌科細菌4株，包括肺炎克雷伯菌2株（表達blaESBL：17-W37-40；表達blaKPC：17-R01-39）、大腸埃希菌2株（表達blaESBL：17-W09-26；表達blaKPC：18-W01-29），銅綠假單胞菌2株（碳青霉烯類敏感：17-W07-23；碳青霉烯類耐藥：17-W48-62）。肺炎克雷伯菌標準菌株ATCC 700603和銅綠假單胞菌標準菌株ATCC 27853為復旦大學附屬華山醫院抗生素研究所保存菌種。

1.1.2 受試藥物與培養基 受試藥物溶液由阿維巴坦對照品粉劑（藥明康德），頭孢他啶標準品粉劑（中國藥品生物制品檢定所）配制。Mueller-Hinton（MH）瓊脂和營養瓊脂為英國OXIOD公司商品；陽離子調節MH肉湯（CAMHB）為美國BD公司商品。

1.2 方法

1.2.1 藥物敏感性試驗和最低殺菌濃度（MBC）測定 根據美國臨床和實驗室標準化協會（CLSI）M100-S28和CLSI文件M26-A標準[1-2]，采用肉湯微量稀釋法對受試菌進行頭孢他啶-阿維巴坦藥物敏感性試驗并進行結果判讀。判讀最低抑菌濃度（MIC）結果后，對所有未見細菌生長孔中的菌藥混合液取0.1 mL加至無藥營養瓊脂培養基，置于35℃溫箱過夜培養。若受試菌在平板上生長的菌落數≤0.1%接種菌量，即可認為該藥物濃度為MBC。MBC/MIC≤4時，認為該藥物具殺菌作用[3]。

1.2.2 時間-殺菌曲線試驗 參考CLSI文件M26-A等[2,4]所述方法對受試標準菌株和臨床分離的共8株菌株進行時間-殺菌曲線試驗。

受試菌菌液制備用無菌接種環輕輕接觸3個經純分單菌落的頂部，然后將接種環上的受試菌接種于CAMHB中過夜增菌培養，次日按0.2%接種量重懸于CAMHB，37℃ 150 r/min震蕩孵育2 h后，稀釋至0.5麥氏濁度，并在CAMHB中進一步1∶1 000稀釋得到受試菌菌液。

抗菌藥物制備依據受試菌的MIC，使用頭孢他啶儲備液對倍稀釋制備得0.5MIC、1MIC、2MIC、4MIC、8MIC、16MIC、32MIC系列濃度，并加入固定濃度的阿維巴坦溶液使其阿維巴坦終濃度為4 mg/L。

取一管未加抗生素的菌液作為生長對照，并對其進行菌落計數，記錄為0 h（t0）的菌落數。系列濃度藥物與受試菌液混合，于37℃，150 r/min條件下震蕩溫育。在2、4、6、10、24 h 5個時間點對所有管取樣0.1 mL，經相應10倍、100倍稀釋后加至無藥營養瓊脂培養基表面并使用一次性涂布棒涂勻。將所有平板置于35℃溫箱過夜培養18 h，次日進行菌落計數以繪制時間-殺菌曲線。

以細菌存活數為縱坐標，時間為橫坐標，以t0點為抗菌藥物溶液加入受試菌菌液時間點，使用繪圖軟件Prisim繪制時間-殺菌曲線。細菌存活數下降≥3 lgCFU/mL值，則認為頭孢他啶-阿維巴坦在該濃度下對受試菌有殺菌作用。

2 結果

2.1 MIC與MBC

頭孢他啶-阿維巴坦對8株受試菌的MIC與MBC結果如表1所示。受試腸桿菌科細菌MIC范圍為0.25～1 mg/L，銅綠假單胞菌MIC范圍為1～2 mg/L，根據CLSI標準，所有受試菌均對頭孢他啶-阿維巴坦敏感。頭孢他啶-阿維巴坦對腸桿菌科細菌的MBC均在相應MIC的4倍及以下，具有良好的殺菌效果。而頭孢他啶-阿維巴坦對銅綠假單胞菌的殺菌效果不如腸桿菌科細菌，盡管受試菌17-W07-23與17-W48-62對頭孢他啶-阿維巴坦敏感，其MBC/MIC＞4。

2.2 殺菌曲線試驗

2.2.1 腸桿菌科細菌 頭孢他啶-阿維巴坦對受試的兩種基因型（blaESBL和blaKPC）的肺炎克雷伯菌、大腸埃希菌及質控菌株均具有較強的殺菌效果，殺菌曲線見圖1～3。在其相應的4倍及以上MIC藥物濃度時，腸桿菌科受試菌殺菌曲線下降趨勢與時間成正相關，且不隨藥物濃度改變有明顯改變。所有菌株在0～6 h內細菌存活數均減少了≥3 lgCFU/mL，殺菌率達99.9%。當藥物濃度小于4 MIC時，盡管在部分時刻殺菌率可達99.9%，但或將發生未殺滅細菌再次增殖的現象，（t+24）h可觀察到大量存活細菌。在1MIC藥物濃度下，大腸埃希菌blaESBL陽性株17-W09-26于（t+4） h附近，肺炎克雷伯菌blaKPC陽性株17-R01-39及質控菌肺炎克雷伯菌ATCC 700603于（t+6）h附近開始出現曲線反跳；在2MIC藥物濃度下，肺炎克雷伯菌ATCC 700603于（t+10）h附近開始出現曲線反跳。

表1 受試菌株最低抑菌濃度與最低殺菌濃度Table 1 Minimum inhibitory and bactericidal concentrations of ceftazidime-avibactam for the strains tested

圖1 頭孢他啶-阿維巴坦對肺炎克雷伯菌臨床分離株17-R01-39和17-W37-40的時間-殺菌曲線Figure 1 Time-kill curves of ceftazidime-avibactam against clinical isolates of K. pneumoniae 17-R01-39 and 17-W37-40

圖2 頭孢他啶-阿維巴坦對大腸埃希菌臨床分離株17-W09-26和18-W01-29 的時間-殺菌曲線Figure 2 Time-kill curves of ceftazidime-avibactam against clinical isolates of E. coli 17-W09-26 and 18-W01-29

2.2.2 銅綠假單胞菌 頭孢他啶-阿維巴坦對銅綠假單胞菌受試菌18-W01-29與質控菌株銅綠假單胞菌ATCC 27853殺菌效果較好，但對受試菌17-W07-23殺菌效果不佳，殺菌曲線見圖3、4。受試菌18-W01-29與質控菌株銅綠假單胞菌ATCC 27853在藥物濃度大于4 MIC時，所有試驗菌株的存活細胞數呈時間依賴性減少，4條曲線基本重合，殺菌率達99.9%。與腸桿菌科細菌類似，當藥物濃度小于4 MIC時，頭孢他啶-阿維巴坦對銅綠假單胞菌的殺菌曲線存在反跳現象。此外，臨床分離株17-W07-23各濃度曲線均出現反跳，在32MIC高濃度頭孢他啶-阿維巴坦條件下仍無法被有效殺滅。

圖3 頭孢他啶-阿維巴坦對標準菌株肺炎克雷伯菌ATCC 700603和銅綠假單胞菌ATCC 27853的時間-殺菌曲線Figure 3 Time-kill curves of ceftazidime-avibactam against reference strains K.pneumoniae ATCC 700603 and P.aeruginosa ATCC 27853

圖4 頭孢他啶-阿維巴坦對銅綠假單胞菌臨床分離株17-W07-23和17-W48-62的時間-殺菌曲線Figure 4 Time-kill curves of ceftazidime-avibactam against clinical isolates of P. aeruginosa 17-W07-23 and 17-W48-62

3 討論

自上世紀90年代起，全球范圍內陸續發現了各菌屬耐碳青霉烯類細菌[5-7]。耐碳青霉烯類細菌的出現嚴重影響了碳青霉烯類藥物的療效，其引起的侵襲性感染與病死率高度相關。如今，世界衛生組織已將CRE及耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌列為首批最為重要的病原體，新型抗菌藥物的研發與投入使用成為了當前的迫切需求。碳青霉烯酶屬于β內酰胺酶的一種，是CRE最主要的耐藥機制之一[8]。故將新型β內酰胺酶抑制劑阿維巴坦與對銅綠假單胞菌有著抗菌活性優勢的第三代頭孢菌素頭孢他啶聯用，此聯合對CRE及耐碳青霉烯類的銅綠假單胞菌均具有良好療效。

國內外一些針對頭孢他啶-阿維巴坦的體外抗菌活性研究進行了實驗與分析[9-10]，阿維巴坦是一種對廣譜β內酰胺酶以及A類、C類和部分D類β內酰胺酶具有活性的新型β內酰胺酶抑制劑，可有效提高多重耐藥和泛耐藥腸桿菌科細菌、銅綠假單胞菌對頭孢他啶的敏感率。本研究將體外MBC作為靜態參考指標，使用時間-殺菌曲線方法對0.5～32 MIC系列濃度下頭孢他啶-阿維巴坦的體外殺菌效果進行動態評估。受試菌MBC≤4 MIC時[3]，認為頭孢他啶-阿維巴坦對其具有較好的殺菌作用。體外殺菌試驗結果顯示，頭孢他啶-阿維巴坦對產超廣譜β內酰胺酶和KPC酶的腸桿菌科細菌及部分敏感銅綠假單胞菌具有良好的殺菌活性。殺菌曲線與相應的MBC結果基本一致。對于多數菌株，頭孢他啶-阿維巴坦藥物濃度為0.5、1 MIC時不具有殺菌效果，而藥物濃度≥4 MIC時，各濃度曲線基本重合，殺菌效果顯著。Zhang等[11]的研究同樣顯示，頭孢他啶-阿維巴坦對產KPC酶、部分OXA酶的肺炎克雷伯菌具有顯著的殺菌效果。該研究還表明，頭孢他啶-阿維巴坦與氨曲南聯用對產NDM酶的肺炎克雷伯菌有較強的協同殺菌作用 。

本研究顯示，當頭孢他啶-阿維巴坦藥物濃度低于菌株相應的MBC時，受試菌存活細菌數在短時間下降后再次增多，殺菌曲線出現反跳。對于這種反跳現象，Keepers等[4]研究認為，β內酰胺酶復合制劑殺菌曲線的反跳可能與β內酰胺酶抑制劑的濃度以及不同菌株不同的β內酰胺酶表達水平相關。文獻報道對大部分菌株而言，當阿維巴坦用量大于4 mg/L標準濃度時，頭孢他啶-阿維巴坦的抗菌效果不隨阿維巴坦的濃度增加而明顯增加[12-13]，但將阿維巴坦濃度調整為8 mg/L或在6 h時加入額外的阿維巴坦溶液可抑制個別菌株24 h時的曲線反跳[4]。

總之，頭孢他啶-阿維巴坦對本實驗中多重耐藥及泛耐藥腸桿菌科細菌和銅綠假單胞菌具有較好的體外殺菌活性，其抗菌作用與和細菌接觸的時間在一定時間內呈正相關，屬于時間依賴性抗生素。如若劑量不足，其殺菌曲線仍可能在幾小時后出現反跳，提示在臨床治療中可采取適當縮短給藥間隔的方式維持其血藥濃度以達到更好的療效。