全國7所兒童醫院臨床分離真菌耐藥性監測

于文文， 李 政， 王傳清， 陳學軍， 趙瑞珍， 楊錦紅， 余建華， 高 巍， 李 靜，張春艷， 寇琳娜， 王世富

近年來由于廣譜抗生素、激素和免疫抑制劑的廣泛應用，以及侵襲性治療的增加，侵襲性真菌感染的發病率不斷上升[1-2]，其中常見致病真菌念珠菌屬、隱球菌屬和曲霉屬感染的年發病率已經達到萬分之一以上，侵襲性念珠菌感染的發生率已經升至醫院感染的第4位[3-4]。隨著抗真菌藥物特別是唑類抗真菌藥物如氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑等在臨床上的大量使用，真菌耐藥現象日趨嚴重。真菌有高適應性特點，在體內形成生物被膜、轉變成菌絲后可高度耐藥，耐藥性成為侵襲性真菌感染治療失敗的主要原因之一[5]。國內有關兒童真菌感染的菌株分布及耐藥性的研究較少。本研究對全國的兒童感染性疾病病原學及細菌耐藥監測協作 組（Infectious Disease Surveillance of Pediatric，ISPED）中7所醫院2016—2018年分離的真菌進行了分離鑒定和耐藥性監測分析，了解臨床分離真菌譜的變化趨勢，監測其對常用抗真菌藥物的敏感率和耐藥率，以引起臨床醫師對臨床分離真菌及抗真菌藥物合理應用的重視，為臨床兒童侵襲性真菌感染的有效診斷、治療提供理論和數據依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株收集 本研究依托于ISPED中山東大學齊魯兒童醫院、復旦大學附屬兒科醫院、浙江大學醫學院附屬兒童醫院、深圳市兒童醫院、溫州醫學院附屬育英兒童醫院、西安市兒童醫院、河南省開封市兒童醫院7所三級甲等兒童教學醫院，收集患兒無菌體液，包括血液、腦脊液的相關真菌數據資料。收集2016年1月1日—2018年12月 31日真菌330株，剔除同一患兒不同標本分離出的重復菌株后為199株。同一患兒不同時間同類標本，只對初次分離菌株進行分析。

1.1.2 試劑和儀器 沙氏葡萄糖蛋白胨瓊脂平皿、真菌藥敏接種肉湯、去離子水、0.5 麥氏濁度標準品、比濁儀、加樣器均為Thermo Fisher公司商品，藥敏板（ATB FUNGUS 3 板）由各參與單位購自法國生物梅里埃公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株鑒定 嚴格按照《全國臨床檢驗操作規程》（第4版）進行，分離的真菌菌株接種至科瑪嘉顯色培養基或沙堡弱真菌培養基，根據生長菌落的顏色，結合VITEK 2-Compact YST卡或質譜進行初步鑒定和復核。

1.2.2 藥敏試驗及判斷標準 采用梅里埃酵母樣真菌藥敏試劑盒ATB FUNGUS 3微量稀釋法，將待測酵母樣真菌的懸浮液轉移到培養基中，并接種到試條上。將藥敏檢測板在35℃真菌培養箱內孵育24～25 h，孵育后通過肉眼判讀，或者應用ATB 儀器或 mini API（自動判讀軟件稍后提供）判讀杯狀凹中菌液的生長情況，及其抗真菌藥物的最低抑菌濃度（MIC）。氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑和5-氟胞嘧啶藥敏參照2017年美國臨床和實驗室標準化協會（CLSI）M60-S1文件[6]和2020年歐洲共同體藥敏試驗委員會（EUCAST）10.0標準[7]，流行病學界值（epidemiological cutoff value，ECV）參照CLSI M59-S2等折點的標準判斷[8-10]。各參與單位真菌藥敏結果復核采用E試驗法：氟康唑、伏立康唑、氟胞嘧啶、伊曲康唑（安圖生物公司），質控菌株為近平滑念珠菌 ATCC 22019和克柔念珠菌ATCC 6258。

1.2.3 統計學分析 采用WHONET 5.6統計分析軟件進行比較分析。采用SPSS 22.0版對數據進行統計學分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 菌株分布

納入研究的199株臨床分離真菌，其中血液標本占比97.0%（193份）、腦脊液占3.0%（6份）。來自男孩110株，女孩89株，男孩略多于女孩，但菌種構成差異不大。年齡分布為1 d～15歲，中位年齡1.6歲。菌株主要來自于重癥醫學科（62株）、新生兒科（43株）、血液腫瘤科（15株）等。前三位的真菌為近平滑念珠菌36.2%（72株）、白念珠菌28.1%（56株）、熱帶念珠菌13.6%（27株），光滑念珠菌4.0%（8株），新型隱球菌2.5%（5株）。見表1。

2.2 藥敏試驗

近平滑念珠菌對氟康唑、伏立康唑、伊曲康唑的敏感率分別為92.0%、96.0%、92.0%。白念珠菌對氟康唑、伏立康唑、伊曲康唑的耐藥率分別為8.7%、11.4%、47.8%。熱帶念珠菌對氟康唑、伏立康唑、伊曲康唑的耐藥率均較高，分別為37.5%、37.5%、60.0%。由于部分真菌藥敏沒有CLSI和EUCAST標準而采用ECV折點，統計時不做敏感耐藥分析，僅進行野生型菌株的報告。見表2。

2.32016 —2018年主要真菌菌株構成變化

2016、2017 年以近平滑念珠菌為主，其次為白念珠菌。2018年真菌譜構成以白念珠菌為主，其次為近平滑念珠菌、熱帶念珠菌，其中近平滑念珠菌占比由2016年的52.9%減少到2018年的26.4%，熱帶念珠菌占比由2016年的9.8%增加到2018年的24.5%。見表3。

表1 臨床無菌體液分離真菌菌種分布及患者性別構成Table 1 Distribution of the fungal strains isolated from sterile body fluids and the sex composition of patients

表2 真菌對抗真菌藥物的敏感率和耐藥率Table 2 Susceptibility of fungal strains to the commonly used antifungal agents

表2（續）Table 2（continued）

表3 2016—2018年臨床分離的主要真菌菌株構成變化Table 3 Distribution of fungal strains isolated from 2016 to 2018

3 討論

本研究收集2016—2018年來自全國7所兒童醫院的199株無菌體液中的真菌數據，以華東地區為主，以及深圳、西安、開封兒童醫院，因此能基本反映中國兒童無菌體液中的真菌病原譜和耐藥率。病原菌中近平滑念珠菌居首，其次為白念珠菌、熱帶念珠菌、光滑念珠菌，與Xiao等[12]報道的2015—2017年CHIF-NET 0～17歲年齡組近平滑念珠菌（31.8%）的占比高于白念珠菌（31.0%）一致。熱帶念珠菌分離率顯著增加，由2016年的9.8%增加到2018年的24.5%，可能與其黏附力強，易污染含葡萄糖溶液（如靜脈營養液），容易導致暴發流行有關[12-13]。近年來相關文獻報道，非白念珠菌分離率有上升趨勢，應該引起臨床醫師的高度重視[1-2]。

近幾年隨著廣譜抗生素、腎上腺皮質激素、免疫抑制劑的使用，真菌感染發病率逐年增加，其中尤其以兒童真菌感染發病率最高，占每年全球真菌感染發病率的31.2%[5]。已研究證實醫院內重癥監護患者使用呼吸機和中心靜脈導管可能是侵襲性真菌感染的主要危險因素；腫瘤化療患者存在免疫功能低下和腸黏膜損傷，可導致腸道內共生的念珠菌跨過腸黏膜屏障，形成侵襲性感染；胃腸道手術后使得腸壁損傷，也可導致腸道內共生的念珠菌跨過腸黏膜屏障，形成侵襲性感染[14-15]。本研究中菌株多來自于重癥醫學科、新生兒科和血液腫瘤科，亦證實侵襲性操作、免疫抑制和腸道微生態失衡導致腸黏膜屏障的破壞、病毒引起的繼發感染都是侵襲性無菌體液真菌感染的高危因素。

臨床常用的抗真菌藥物主要有兩性霉素B、三唑類（氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑）、棘白菌素類（卡泊芬凈）、氟胞嘧啶（5-氟胞嘧啶）[16]。本研究分析了氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑、5-氟胞嘧啶四種抗真菌藥物對臨床常見真菌菌株的抗菌情況，其中白念珠菌對氟康唑的耐藥率高達8.7%，高于以前文獻報道的數據，可能與兒童氟康唑的臨床廣泛預防應用和本研究全部選擇的是無菌體液標本有關；熱帶念珠菌對氟康唑的耐藥率高達37.5%，與2010—2017年CHIF-NET報道熱帶念珠菌對氟康唑的耐藥率由低于6%增加到高于30%的一致[12]，并且耐藥率呈現出進一步逐年增加的趨勢。結合熱帶念珠菌分離率占比由2016年的9.8%顯著增加至2018年的24.5%，故國內兒童臨床念珠菌血癥預防和經驗選擇抗真菌藥物，應與IDSA 2016版成人指南一致，首選卡泊芬凈等棘白菌素類藥物[17]。

新型隱球菌和曲霉的CLSI標準中僅有ECV值，大多數醫院限于實驗室條件和菌株量少等因素，沒有進行藥敏試驗，造成了本監測數據中新型隱球菌和曲霉藥敏監測數據較少，需要在下一步的監測中進一步完善對這兩種菌的監測技術培訓。另因Yeast One檢測板收費標準等問題，念珠菌的藥敏檢測板實驗室應用的是FUNGUS 3 鑒定藥敏板，導致了本研究中的念珠菌藥敏監測數據中未含有棘白菌素類抗真菌藥物的數據，同時因為CLSI-M100 （M27-S4）和EUCAST 10.0標準中部分抗真菌藥判斷標準差別較大，需要進一步在國內統一標準，形成專家共識[18]。

綜上所述，通過研究臨床兒童患者常見真菌的菌株構成和藥敏結果，不斷完善兒童群體真菌耐藥監測分析數據，重視基于大數據監測下的真菌藥敏監測，促進臨床醫師對抗真菌藥物合理應用。本監測結果為臨床有效診斷、預防和經驗治療侵襲性真菌病提供更為準確的依據，減少抗真菌藥物選擇壓力，提高兒童侵襲性真菌感染的救治成功率。