基于酶輔助目標物循環及金屬有機框架材料的電化學鏈霉素傳感器

陳穎，高宇

長江大學化學與環境工程學院, 湖北 荊州 434023

抗生素是由微生物自然產生或人為合成的一類化學物質，其抗菌性能被廣泛應用于治療細菌感染，并在農業中作為生長促進劑添加到動物飼料中[1,2]。但是，不當使用抗生素或長期間接攝入食源性抗生素殘留物，可能會導致抗生素在體內的積累，甚至產生一些具有抗菌耐藥性的超級細菌，嚴重威脅人類健康[3]，如過量使用氨基糖苷類抗生素之一的鏈霉素(streptomycin, STR)會導致聽覺神經和腎臟損害等毒副作用[4]。因此，發展有效的抗生素檢測方法已成為迫切需求。

傳統的抗生素檢測方法主要是有生物法、高效液相色譜、氣-質聯用、液-質聯用等[5-9]，這些方法盡管較準確，但也存在大多具有樣品前處理繁瑣、檢測時間長、成本高、儀器價格昂貴、需要專技人員維護等局限性。為了適應抗生素檢測發展的需求，一批基于比色、電化學、電致化學發光、熒光等傳感器檢測方法應運而生[10]。其中，電化學由于具有靈敏度高、響應快、選擇性好、操作簡便且成本低等優點而備受關注，并在抗生素的檢測中得到了一定應用[11]。

靈敏度的提高是傳感器研究的一大關鍵問題，具體的實現途徑主要可歸為納米材料和生物放大策略的使用。金屬-有機框架材料(MOF)是近年來新興的一類由有機配體和金屬離子或團簇通過配位鍵自組裝形成的有機-無機雜化材料。這種材料具有多孔性、大的比表面積及結構功能的可調控性，有望實現在分析檢測中的應用[12]。目前，一般將功能化MOF用作目標物識別元件或信號分子的固載基質，修飾于電極表面，實現目標物的識別和信號的轉導及放大輸出[12-16]。但這通常需要復雜的修飾過程，操作較繁瑣。如何才能在不增加額外修飾步驟的前提下，簡單地產生基于MOF的電化學信號呢?已有研究表明，MOF(UiO-66)具有吸附單鏈DNA(ssDNA)的能力[17-19]，如果利用該MOF直接修飾電極，通過吸附電活性分子標記的ssDNA，就可簡單地實現電化學信號的輸出。此外，作為生物放大策略之一的目標物循環，一般是利用核酸酶的催化作用釋放被捕獲的目標物，使得目標物循環參與分子識別過程，達到n倍放大信號的目的。為了進一步降低檢測出限，在傳感器的構建中還可聯用兩種甚至多種信號放大策略，達到檢測信號的級聯放大效果。

適體(aptamer, Apt)是用配體指數富集法系統演化(SELEX)技術篩選得到的一段能與靶分子特異性結合的寡核苷酸序列，具有靶分子范圍廣、親和力高、特異性強、穩定性好、易于獲取等優點。為此，筆者構建了一種基于酶輔助目標物循環信號放大策略和MOF修飾電極的高靈敏電化學適體傳感器，并應用于定量檢測以STR為模型目標物的抗生素。STR與磁珠表面DNA雙鏈雜交體(dsDNA)中的適體鏈結合，形成3’端暴露的Apt-STR復合物，引發在核酸外切酶Ⅰ(Exo Ⅰ)輔助下Apt-STR復合物中Apt的降解作用，釋放出STR循環參與生物識別過程[20]。由于Apt與STR的結合使得Apt從dsDNA中移除并釋放出標記了二茂鐵的信號探針(Fc-SP)，在酶輔助目標物循環作用下，少量STR即可從磁珠表面去除大量適體，繼而釋放出大量Fc-SP，吸附于MOF修飾電極表面。通過對電極表面的Fc-SP進行電化學檢測，從而實現STR的定量分析。由于酶輔助目標物循環的高效信號放大能力，磁珠易于分離富集的優點，及MOF修飾電極優良的電化學性能和易操作性，該方法有望構建靈敏高效簡單的抗生素傳感器，實現對STR的準確分析。

1 試驗部分

1.1 試劑與儀器

氯化鋯(ZrCl4),Aladdin化學試劑有限公司；2-氨基對苯二甲酸，Macklin生化科技有限公司；N，N-二甲基甲酰胺(DMF)和甲醇，錫龍化工有限公司。Tris-HCl、巰基己醇(MCH)，Sigma-Aldrich公司；核酸外切酶Ⅰ(Exo Ⅰ)，New England Biolab公司。一次性印刷碳電極(SPCE)由碳工作電極(直徑3mm)、碳對電極和銀參比電極組成，Zensor R&D有限公司。雜交緩沖溶液(HB)由10mmol/L Tris-HCl, 500mmol/L NaCl 及 1mmol/L MgCl2(pH=7.4)組成。羧基磁珠偶聯試劑盒(包含羧基化磁珠MB-COOH、活化液、偶聯液、封閉液、儲存液、N-(3-二甲氨基丙基)-N’-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、N-羥基琥珀酰亞胺磺酸鈉鹽(sulfo-NHS)),試驗所用DNA訂購于生工生物工程技術服務有限公司，其序列如下：

鏈霉素適體(STR Apt)：5’-GGGGTCTGTTCTGCTGCTTTGTTCTGTCGGGTCGTCTGCAGGTCGACGCATGCGCCG-3’適體互補鏈(NH2-cDNA)：5’-ACGACCCGACAGAACAAAGCAGCAGAACAGACCCC-(CH2)6-NH2-3’標記二茂的鐵信號探針(Fc-SP)：5’-Fc-(CH2)6-CGGCGCATGCGTCGACCTGCAG-3試驗過程中使用超純水經雷磁超純水過濾凈化系統得到。電化學循環伏安法(CV)及方波伏安法(SWV)在CHI660E電化學工作站上操作完成。采用JEM2100F透射電子顯微鏡和布魯克D8 Advance x射線衍射儀表征所制備的UiO-66-NH2材料。

1.2 MOF(UiO-66-NH2)材料的合成

采用溶劑熱法合成了UiO-66-NH2MOF材料，步驟如下：首先，將0.2399g ZrCl4和0.1819g 2-氨基對苯二甲酸分散在50mL DMF中。充分攪拌后，將該混合物轉移到100mL聚四氟乙烯內襯高壓反應釜中，在120℃下加熱反應48h，然后自然冷卻至室溫。離心收集產物，用DMF/CH3OH徹底洗滌。最后，在90℃條件下干燥12h，即可得到UiO-66-NH2粉末。

1.3 MB-dsDNA共軛物的制備

將等物質的量的STR Apt、NH2-cDNA與Fc-SP混合于雜交緩沖液中至三者最終濃度分別為2×10-6mol/L，將所得溶液水浴加熱至90℃保持5min，再緩慢降至室溫，整個降溫過程至少1h，形成具有- -NH2和- -Fc末端的DNA雙鏈體(dsDNA)。接著利用羧基磁珠偶聯試劑盒，通過dsDNA的- -NH2與MB-COOH發生酰胺化反應，將dsDNA固定于MB表面，制備MB-dsDNA共軛物。具體步驟簡述如下：首先，將100μL MB-COOH(50μg/μL)洗滌3次后分散于含有5mg的EDC和5mg的sulfo-NHS 的活化緩沖溶液中，搖床上溫育30min活化羧基。磁性分離上清液后，將活化后的MB-COOH (5μg/μL)與上述含有- -NH2末端dsDNA的偶聯緩沖液混勻，置于搖床上在室溫條件下溫育90min，以完成酰胺化反應。隨后，磁性分離，棄去上清液，收集MB-dsDNA共軛物，向其中加入1mL封閉液，室溫下溫育30min。最后，將制備的MB-dsDNA共軛物洗滌并再次分散于1mL儲備液中，4℃條件下保存備用。

1.4 STR傳感器的構建

將SPCE置于20mmol/L Tis-HCl緩沖液(pH=7.4)中，設置電位范圍為-0.6～0.6V、掃速0.5V/s，進行電化學CV掃描直至伏安圖穩定為止，取出SPCE沖洗并用氮氣吹干。將上述預處理好的SPCE浸入鐵氰化鉀溶液中掃描表征裸電極表面的電化學行為。SPCE沖洗吹干后，立即向碳工作電極區域滴加10μL制備好的MOF懸濁液(1mg/mL)，室溫晾干，使得碳工作電極表面形成一層均勻的MOF膜。以MB-dsDNA共軛物(1μg/μL)作為電化學探針，與含不同質量濃度STR和Exo Ⅰ(200U/mL)的PBS溶液(0.1mol/L，含0.1mol/L的KCl，pH=7.4)在37℃條件下溫育30min，完成目標物STR誘導在Exo Ⅰ作用下Apt的降解，釋放出Fc-SP。磁性分離后收集上清液，并分別與MOF/SPCE溫育2h。隨后采用SWV在10mmol/L PBS溶液中檢測對應電極吸附Fc-SP所得電流強度。SWV檢測參數設置如下：電位掃描范圍為-0.2～0.6V，頻率為25Hz，振幅為25mV。

2 STR檢測原理

設計了一種基于酶輔助目標物循環和MOF修飾電極的靈敏簡單電化學適體傳感器，實現了以STR為模型目標物的抗生素分析，具體原理如圖1所示。首先，將3種不同的DNA(STR Apt、NH2-cDNA、Fc-SP)退火雜交，形成具有氨基和二茂鐵修飾末端的DNA雙鏈體(NH2-dsDNA-Fc)，再通過酰胺化反應將NH2-dsDNA-Fc修飾于MB-COOH表面，制備具有分子識別功能和電化學信號標簽的MB-dsDNA共軛物。當STR不存在時，Exo Ⅰ無法降解組裝于MB表面的dsDNA。一旦STR存在，它與固定于MB-dsDNA中的STR Apt結合，形成3’端暴露的Apt-STR復合物，致使dsDNA解旋，釋放出Apt和Fc-SP。含有3’端暴露適體的Apt-STR復合物激活Exo Ⅰ催化降解STR Apt，釋放出STR。釋放出的STR可再次與固定于MB表面的適體結合并在Exo Ⅰ作用下再次釋放，如此循環，即使少量的STR也能導致大量MB表面適體的移除，隨之釋放出大量Fc-SP。釋放出的Fc-SP與目標物STR質量濃度成正相關，通過MOF修飾電極將釋放出的Fc-SP吸附于電極表面實現電化學信號輸出。由于目標物STR質量濃度越高，釋放出的信號分子Fc-SP越多。電流強度隨著目標物STR質量濃度的增加而遞增，以此作為定量分析依據。由于Exo Ⅰ輔助目標物循環的信號放大能力、MOF材料對信號探針的高效吸附及信號輸出能力，以及操作過程的便捷性，該方法有望實現簡單靈敏的STR分析。

圖1 電化學生物傳感器檢測STR的原理示意圖Fig.1 Schematic illustration of the electrochemical biosensor for STR detection

3 結果與討論

3.1 UiO-66-NH2的表征

采用TEM對合成的MOF材料(UiO-66-NH2)進行了形貌表征。圖2(a)顯示所制備材料呈現出均勻的顆粒形貌，平均直徑約為60～80nm，這與之前研究報道結果一致[14,21]。圖2(b) 為材料XRD表征，所得XRD圖譜也與之前文獻結果相符[14]。綜合TEM和XRD表征結果均表明了UiO-66-NH2的成功制備。

圖2 UiO-66-NH2的表征Fig.2 Characterization of UiO-66-NH2

3.2 傳感器制備過程的電化學表征及可行性分析

以[Fe(CN)6]3-/4-為氧化還原指示劑，采用循環伏安法研究了不同電極表面的電化學行為，如圖3(a)所示。從圖3(a)可以看出，裸SPCE呈現出一對可逆性良好的氧化還原特征峰(曲線a)。修飾上一層MOF之后，MOF/SPCE產生的峰電流強度略有下降(曲線b對比曲線a)，這是由于UiO-66-NH2與絕大多數MOF一樣導電性較差造成的。將定量的MB-dsDNA共軛物與含有不同質量濃度STR和定量Exo Ⅰ的PBS溶液溫育后，磁性分離收集上清液。收集的上清液再溫育MOF/SPCE，所得峰電流強度呈現出進一步下降的現象(曲線c)。這是由DNA負電荷磷酸鹽骨架與負電性[Fe(CN)6]3-/4-之間的排斥作用及空間位阻效應所導致。以上結果表明DNA在MOF/SPCE表面的成功吸附，說明了傳感界面的成功制備，也初步反映了目標物STR能夠誘導MB-dsDNA共軛物釋放出ssDNA(Fc-SP)。

為了進一步評估傳感器構建的可行性，研究了不同電極對應的SWV響應曲線，如圖3(b)所示。在無STR存在時，MOF/SPCE與反應上清液溫育后，未觀察到峰電流(曲線a)，此為空白對照實驗的背景響應信號。然而，當MOF/SPCE與STR(5ng/mL)存在時的反應上清液溫育后，產生了明顯的峰電流(曲線b對比a)，其峰電位與Fc氧化還原峰電位相當，這意味著目標物STR成功誘導MB-dsDNA解旋，釋放出Fc-SP并吸附于MOF/SPCE表面。因此，只有STR的存在才能導致固定于磁珠表面的dsDNA解旋釋放出信號探針Fc-SP，作為STR的定量分析依據，否則，STR誘導信號探針的釋放及其吸附都處于禁阻狀態。該結果再次證明了所構建傳感器應用于STR檢測的可行性。

注：a為裸SPCE，b為MOF/SPCE，c為MOF/SPCE溫育STR反應上清液。圖3 電極逐步修飾過程的電化學表征Fig.3 Electrochemical characterization of the stepwise modified SPCE

3.3 靈敏性

對不同目標物質量濃度分別進行了檢測并記錄數據，通過峰電流強度與對應STR質量濃度的關系評估了該方法的靈敏度。圖4(a)記錄了不同STR質量濃度所對應的SWV響應信號。在目標物STR不存在的空白對照試驗中，未觀察到明顯的峰電流(曲線a)。當STR存在時，對應的SWV響應信號呈現出峰電流(曲線b至h)，并且隨著STR質量濃度的增加，檢測到對應于Fc的峰電流強度也相應增加。這是由于高質量濃度的STR可以使得固定于磁珠表面的dsDNA在Exo Ⅰ輔助下釋放出更多Fc-SP，吸附于MOF/SPCE表面，獲取電流強度劇烈增加的SWV信號。如圖4(b)所示，響應電流強度與STR質量濃度的對數值在0.3～150ng/mL范圍內呈線性關系，并估算出檢出限(LOD)約為0.2ng/mL。由于適體與目標物STR的特異性識別作用、Exo Ⅰ酶輔助目標物循環高效的信號放大能力及MOF/SPCE在信號分辨和放大方面的優越性能，該方案相較于其他檢測方法而言[22-24]，顯現出相當甚至更高的靈敏度以及較寬的檢測范圍。

注：曲線a至h分別對應STR質量濃度為0、0.3、0.5、1、2、5、20、150ng/mL。圖4 目標傳感器的靈敏度評估Fig.4 Sensitivity evaluation of target biosensor

3.4 選擇性

為了評估傳感器對STR測定的選擇性，分別選取氯霉素(CAP)、卡那霉素(KAN)和土霉素(OTC)3種抗生素作為干擾物進行測定。如圖5所示，相同質量濃度(20ng/mL)的CAP、KAN和OTC對應的SWV檢測響應信號與空白試驗相比差異不大。然而，即使對較低質量濃度(2ng/mL)STR的測定，也得到了顯著的信號增量。這表明只有STR才能導致SPCE表面適體DNA鏈的去除，從而釋放出Fc-SP吸附于MOF/SPCE表面，產生信號。此外，使用STR和非目標物抗生素的混合物進行了交叉干擾實驗：與STR的單獨檢測相比，混合物的存在也沒有引發峰值電流強度的明顯變化。這表明即使在共存條件下非目標抗生素對STR也幾乎沒有干擾效應。結果表明，該方法具有良好的選擇性。

圖5 目標傳感器的選擇性評估 Fig.5 Selectivity evaluation of target biosensor

3.5 實際樣品中STR的檢測

通過對從湖北省荊州市當地超市獲得的牛奶樣品進行加標回收試驗，研究了該方法測定復雜樣品中STR的可行性。將牛奶樣品高速離心，經微孔膜(0.22μm)過濾后，稀釋10倍，未檢測出STR。加入不同質量濃度的STR進行加標回收試驗，3種樣品的回收率分別為105%、98.2%和104%。該結果表明了傳感器具有實現復雜樣品中STR檢測的應用潛力。

4 結論

1)基于酶輔助目標物循環的高效信號放大能力及MOF修飾電極優良的電化學性能，筆者構建了一種靈敏高效簡單的抗生素適體傳感器。

2)該傳感器對STR的檢測具有較寬的線性范圍(0.3～150ng/mL)、低至0.2ng/mL的檢出限、良好的選擇性，并可用于實際牛奶樣品中的STR檢測。

3)該方法具有有效靈敏檢測抗生素STR的能力，為食品分析領域提供方法學支撐，為公共衛生安全提供一定程度的技術支持。