西地那非通過STAT3和Akt/GSK-3β途徑對哮喘小鼠氣道炎癥和重塑的作用研究

陳麗娜 薛岑 杜麗娟 祝勁

哮喘是最常見的慢性呼吸系統疾病之一，其特征是氣道炎癥、氣道重塑、氣道高反應性、杯狀細胞增生和粘液高分泌。慢性炎癥引起的氣道重塑在難治性哮喘的發病機制中起著非常重要的作用[1]。氣道平滑肌質量增加，是氣道結構變化的關鍵。氣道平滑肌細胞增生和肥大，是增加氣道平滑肌質量，導致哮喘氣道重塑的主要原因[2]。STAT3/Akt/GSK-3β途徑是細胞內信號轉導的重要通路之一，已有研究表明，STAT3/Akt/GSK-3β途徑參與調節哮喘平滑肌細胞表型轉換，對哮喘氣道重塑有重要作用[3]。西地那非是美國食品藥品管理局批準的用于治療勃起功能障礙和肺動脈高壓的口服藥物。西地那非是一種有效的磷酸二酯酶(phosphodiesterase ，PDE)5抑制劑，其通過抑制PDE5，使得細胞內環鳥苷單磷酸(cyclic guanosine monophosphate ，cGMP)信號持續激活，促進肺動脈血管平滑肌細胞舒張并發揮抗增殖作用，從而降低肺動脈壓，抑制血管重塑[4]。除了對肺血管的有益作用外，另有研究表明，西地那非對慢性阻塞性肺疾病合并肺動脈高壓患者，也有一定的有利作用，如增加運動能力，BODE指數和改善生活質量[5]，提示西地那非可能對肺功能異常有抑制作用。目前，還未有西地那非對哮喘的作用研究。綜上所述，本研究通過OVA誘導建立小鼠哮喘模型，旨在探究西地那非對哮喘小鼠氣道炎癥和重塑的影響及其作用是否與STAT3和Akt/GSK-3β途徑相關，以期為哮喘治療藥物的開發提供新的科學依據。

資料與方法

一、材料

1 主要試劑

西地那非購自美國selleck公司；地塞米松和卵清蛋白(OVA)購自美國Sigma公司；TNF-α、IL-1β、IL-4和IL-13檢測試劑盒購自上海江萊生物科技有限公司；IgE和OVA特異性LgE檢測試劑盒購自上海吉雅生物科技有限公司；糖原PAS染色液試劑盒購自北京索萊寶公司；Masson三色染色試劑盒購自南京森貝伽生物科技有限公司；α-SMA抗體購自英國Abcam公司；p-STAT3、STAT3、p- Akt、Akt、p-GSK-3β和GSK-3β抗體購自美國Cell Signalling Technology；GAPDH抗體購自武漢三鷹生物技術有限公司；ECL化學發光超敏顯色試劑盒購自上海翊圣生物科技有限公司。

2 實驗動物

40只雄性BALB/c小鼠，6周齡，體質量(18±2)g購自貴州醫科大學實驗動物中心。所有小鼠飼養于22±2℃、相對濕度45%～55%條件下，提供充足的飲水及飼料。待小鼠適應環境一周后，進行后續實驗。

二、動物分組及給藥處理

待小鼠適應環境一周后，將小鼠隨機分為：對照組、哮喘組、西地那非低劑量組、西地那非高劑量組和陽性對照組，每組各8只。除對照組外，其余組小鼠于第1、7、14天用0.2mL OVA混懸液(含10μg OVA和1mg氫氧化鋁)腹腔注射致敏。從第21天起，霧化吸入25g/L OVA(生理鹽水溶解)激發30min，隔天激發1次，連續8周[6]。對照組注射和霧化吸入等量生理鹽水。西地那非低、高劑量組小鼠在霧化激發前1h給予腹腔注射西地那非12.5mg/kg和25mg/kg[7]，陽性對照組腹腔注射地塞米松2mg/kg[8]。對照組和哮喘組小鼠注射生理鹽水。

三、支氣管肺泡灌洗液(BALF)的收集及細胞計數

小鼠麻醉后處死，行氣管插管，灌入生理鹽水灌洗肺部，隨后抽回生理鹽水，即為BALF。血球計數儀進行BALF總細胞數的計數，隨后1000rpm離心5min后，生理鹽水重懸沉淀，涂于載玻片上，瑞士-吉姆薩染色后對嗜酸性粒細胞進行計數。

四、ELISA檢測炎性因子、IgE和OVA特異性LgE水平

BALF 3000rpm離心5min，取上清液。根據ELISA試劑盒說明書，檢測BALF上清液中TNF-α、IL-1β、IL-4、IL-13、IgE和OVA特異性LgE水平。

五、HE染色檢測肺組織病理學變化

取小鼠肺組織，4%多聚甲醛固定72h，梯度酒精脫水，二甲苯透明。常規石蠟包埋、切片。肺石蠟切片脫蠟至水，蘇木素染色10min，0.7%鹽酸乙醇分化數秒，流水洗滌后，伊紅液浸染3min。梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。參考文獻[9]，對支氣管周圍和血管周圍炎癥程度進行評估，1分：無明顯炎癥；2分：有少量炎癥細胞；3分：大多數支氣管或血管被一薄層炎癥細胞(1到5個細胞厚)包圍；4分：大多數支氣管或血管被一層厚厚的炎癥細胞(5個以上細胞厚)包圍。

六、過碘酸雪夫(Periodic Acid-Schiff stain ，PAS)染色檢測杯狀細胞增生

按照(五)所示，制備各組小鼠肺石蠟切片。切片常規脫蠟至水，高錳酸酒精溶液反應10min，70%酒精清洗后，入還原液1min，70%酒精清洗后，入無色鹽基性品紅溶液1h。流水沖洗后，蘇木素復染5min，1%鹽酸酒精分化。流水沖洗后，脫水，透明，中性樹脂封片，光學顯微鏡觀察分析。PAS陽性上皮細胞占氣道上皮細胞總數的百分比，即為PAS陽性細胞數(%)。

七、Masson染色檢測膠原纖維沉積

按照(五)所示，制備各組小鼠肺石蠟切片。切片常規脫蠟至水，蘇木素染液染色10min。酸性乙醇分化液分化15s，水洗。Masson藍化液返藍5min，水洗。麗春紅品紅染液10min。磷鉬酸溶液洗1min，弱酸工作液洗1min。苯胺藍染液染色2min。弱酸工作液洗后，酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠固封，Image J軟件分析膠原纖維藍色著染面積。

八、免疫組化檢測α-SMA的表達

按照(五)所示，制備各組小鼠肺石蠟切片。切片常規脫蠟至水，抗原修復。3% H2O2甲醇液孵育10 min，PBS清洗后，5% BSA封閉1h，α-SMA抗體(1 ∶100)4 ℃孵育過夜。二抗(1 ∶500)室溫孵育1 h。DAB顯色液顯色，蘇木素染液染色2 min。1%鹽酸酒精分化10 s。0.2%氨水做返藍處理8 s。自來水沖洗后，切片進行脫水、透明處理，中性樹膠封片，光學顯微鏡觀察分析。

九、Western blot檢測α-SMA蛋白和STAT3/Akt/GSK-3β途徑相關蛋白的表達

取小鼠肺組織剪碎，RIPA裂解液冰上裂解組織，離心取上清，BCA蛋白質定量試劑盒測定蛋白濃度。取30 μg蛋白進行SDS-PAGE分離并轉至PVDF膜上。10%脫脂奶粉封閉，隨后加入α-SMA(1 ∶2 000)、p-STAT3(1 ∶1 000)、STAT3(1 ∶1 000)、p- Akt(1 ∶1 000)、Akt(1 ∶1 000)、p-GSK-3β(1 ∶1 000)、GSK-3β(1 ∶1 000)和GAPDH(1 ∶5 000)抗體，4 ℃條件下過夜孵育。加入二抗(1 ∶5 000)室溫孵育1 h后，滴加ECL發光液到膜上，化學發光成像儀檢測。

十、統計學分析

結 果

一、各組小鼠氣道炎癥的比較

與對照組相比，哮喘組小鼠BALF總細胞數和嗜酸性粒細胞數明顯升高(P<0.05)，TNF-α、IL-1β、IL-4和IL-13水平明顯升高(P<0.05)；與哮喘組相比，西地那非，低、高劑量組和陽性對照組小鼠BALF總細胞數和嗜酸性粒細胞數明顯降低(P<0.05)，TNF-α、IL-1β、IL-4和IL-13水平明顯降低(P<0.05)(見表1、2)。

表1 各組小鼠BALF總細胞數及嗜酸性粒細胞數的比較

表2 各組小鼠炎性因子水平的比較

二、各組小鼠IgE和OVA特異性LgE水平的比較

與對照組相比，哮喘組小鼠IgE和OVA特異性LgE水平明顯升高(P<0.05)；與哮喘組相比，西地那非低、高劑量組和陽性對照組小鼠IgE和OVA特異性LgE水平明顯降低(P<0.05)(見表3)。

表3 各組小鼠IgE和OVA特異性LgE水平的比較

三、各組小鼠肺組織病理學變化的比較

與對照組相比，哮喘組小鼠肺組織支氣管周圍存在明顯的炎癥細胞浸潤，炎癥評分明顯升高(P<0.05)；與哮喘組相比，西地那非低、高劑量組和陽性對照組小鼠肺組織支氣管周圍炎癥細胞浸潤減少，炎癥評分明顯降低(P<0.05)(見圖1，表4)。

圖1 HE染色檢測各組小鼠肺組織病理學變化(HE ×100)

表4 各組小鼠炎癥評分的比較

四、各組小鼠杯狀細胞增生的比較

與對照組相比，哮喘組小鼠肺組織PAS陽性細胞數明顯升高(P<0.05)；與哮喘組相比，西地那非低、高劑量組和陽性對照組小鼠肺組織PAS陽性細胞數明顯降低(P<0.05)(見圖2，表5)。

圖2 PAS染色檢測各組小鼠杯狀細胞增生(HE ×100)

表5 各組小鼠PAS陽性細胞數的比較

五、各組小鼠氣道重塑的比較

與對照組相比，哮喘組小鼠肺組織膠原纖維面積和α-SMA表達明顯升高(P<0.05)；與哮喘組相比，西地那非低、高劑量組和陽性對照組小鼠肺組織膠原纖維面積和α-SMA表達明顯降低(P<0.05)(見圖3、4、5、表6，7)。

表6 各組小鼠膠原纖維面積的比較

圖3 Masson染色檢測各組小鼠膠原纖維沉積(HE ×100)

六、各組小鼠STAT3和Akt/GSK-3β途徑相關蛋白表達的比較

與對照組相比，哮喘組小鼠p-STAT3/STAT3的比值明顯升高(P<0.05)，p-Akt/Akt和p-GSK-3β/GSK-3β的比值明顯降低(P<0.05)；與哮喘組相比，西地那非低、高劑量組和陽性對照組小鼠p-STAT3/ STAT3的比值明顯降低(P<0.05)，p-Akt/Akt和p-GSK-3β/GSK-3β的比值明顯升高(P<0.05)(見圖6，表8)。

表8 各組小鼠STAT3/Akt/GSK-3β通路相關蛋白表達水平的比較

圖4 免疫組織化學染色檢測各組小鼠α-SMA的表達(HE ×400)

圖5 Western blot檢測各組小鼠α-SMA的蛋白表達

圖6 Western blot檢測各組小鼠STAT3/Akt/GSK-3β通路相關蛋白的表達

表7 各組小鼠α-SMA蛋白表達水平的比較

1：對照組；2：哮喘組；3：西地那非低劑量組；4：西地那非高劑量組；5：陽性對照組

討 論

哮喘是兒童和成人最常見的慢性非傳染性綜合征之一，全世界約有3.34億人患有此病，每年約有25萬人死于哮喘[10]。目前哮喘的治療策略主要有長效β2-激動劑、支氣管擴張劑、吸入皮質類固。以上治療策略雖然可以減輕炎癥，但目前還沒有建立有效的治療方法來減輕氣道重塑[11]。因此，需要開發新的治療策略減輕哮喘病理學基礎上的炎癥和重塑過程。西地那非是一種被廣泛用于治療勃起功能障礙和肺動脈高壓的藥物[4]。目前，關于西地那非對哮喘作用的相關研究寥寥無幾。因此，本研究旨在探究西地那非對哮喘的作用及其可能的作用機制，以期為開發更有效的哮喘治療策略提供新的科學資料。

氣道炎癥和氣道重塑是哮喘的兩個主要病理生理特征。哮喘的炎癥反應包括B細胞過度產生IgE、釋放細胞因子以及嗜酸性粒細胞和淋巴細胞等炎癥細胞的浸潤[12]。哮喘氣道重塑的特征是平滑肌肥大和增生、杯狀細胞增生、黏液高分泌、上皮下纖維化和膠原沉積、血管增加和炎性細胞浸潤[13]。因此，控制氣道炎癥和重塑是治療哮喘的關鍵。研究表明，西地那非治療通過抑制心臟炎癥、心臟纖維化和心臟重塑改善燒傷性心功能不全[14]。西地那非除了具有心臟保護功能以外，還對重度慢性阻塞性疾病合并肺動脈高壓大鼠肺泡、細支氣管、間質組織和小動脈的病理學變化有明顯改善作用[15]。本研究結果顯示：在OVA誘導的小鼠哮喘模型中，西地那非以劑量依賴的方式改善哮喘誘導的氣道炎癥及氣道重塑，同時降低BALF中IgE和OVA特異性LgE水平。

STAT3是一種細胞因子的激活轉錄因子，其激活在調節炎癥反應中發揮關鍵作用。一旦受到刺激，導致STAT3 Tyr705位點磷酸化，隨后轉移到細胞核中，從而轉錄調控細胞因子反應基因和細胞因子的產生[16]。因此，STAT3激活可能是哮喘潛在的治療靶點[17]。本研究結果表明：在OVA誘導的小鼠哮喘模型中，STAT3通路活化，而西地那非以劑量依賴的方式抑制STAT3通路活化。Akt/GSK-3β信號通路在哺乳動物細胞中普遍存在，參與調控細胞增殖、凋亡和自噬等多種重要細胞活動[18]。以往的研究表明，硫化氫通過激活PI3K/Akt/mTOR途徑改善脂多糖誘導的小鼠急性肺損傷[19]。線粒體輔酶Q通過激活PI3K/Akt/GSK-3β/mTOR信號通路改善肺組織病理學變化，減輕肺水腫及炎癥細胞浸潤，在膿毒癥誘導的急性肺損傷中發揮保護作用[20]。本研究結果顯示：在OVA誘導的小鼠哮喘模型中，Akt/GSK-3β通路被抑制，而西地那非治療可促進Akt/GSK-3β通路活化。

綜上所述，本研究結果表明，西地那非可抑制哮喘小鼠氣道炎癥及氣道重塑，其作用可能是通過調控STAT3和Akt/GSK-3β通路實現的。該研究結果為明確西地那非在哮喘中的作用及開發新的哮喘治療策略提供了新的科學依據。本研究只初步確認了西地那非對哮喘小鼠氣道炎癥及氣道重塑的改善作用可能與STAT3和Akt/GSK-3β通路有關，并未進行深入研究。因此，后續實驗將進一步探討西地那非在哮喘小鼠中調控STAT3和Akt/GSK-3β通路的具體機制。