宏基因組第二代測序技術對重癥監護兒童支氣管肺炎的病原學研究

楊偉健 唐遠平 朱歡歡 姚仲偉 蘇淑芬 吳松 韓爭爭 張亮 鄭亦男

2016年WHO數據顯示5歲以下兒童，下呼吸道感染的死亡人數達108萬[1]。傳統病原學檢測，高達60%病例無法明確病原體[2]。2008年起mNGS開始臨床應用[3-4]。2016年美國FDA等機構發布mNGS行業指引[5]。2019年中國發布《宏基因組分析和診斷技術在急危重癥感染應用的專家共識》，明確重癥患者應用mNGS適應證、樣本采集及實驗方法。共識推薦下呼吸道感染的重癥患者，需要在下呼吸道的感染部位取材，而非血液樣本[6]。有關下呼吸道取材病原mNGS研究，除了少數成人研究，缺乏兒童內容[7-11]。收治重癥監護室的支氣管肺炎兒童，有迫切的病原學診斷壓力。因此，本研究探討mNGS對重癥監護支氣管肺炎兒童的病原診斷價值。

資料與方法

一、研究對象

收集2019年4月10日至2019年10月10日，廣東省婦幼保健院(廣東省兒童醫院)兒童重癥醫學科收治支氣管肺炎的臨床資料。支氣管肺炎診斷，依據呼吸道癥狀、體征及肺部影像學改變[12]。低氧性呼吸衰竭診斷，依據改良氧合指數(P/F)低于300mmHg[13]。塑形性支氣管炎診斷，依據支氣管鏡檢查[14]。兒童急性呼吸窘迫綜合征診斷，依據2015國際小兒急性呼吸窘迫綜合征專家共識[15-16]。本研究通過廣東省婦幼保健院(廣東省兒童醫院)醫學倫理委員會批準(廣東省婦幼保健院醫倫201801085)，監護人均知情同意并簽署知情同意書。

二、方法

1 支氣管鏡檢查

支氣管鏡檢查適應證、操作規范參考2018年國家衛生健康委員會人才交流服務中心兒科呼吸內鏡診療技術專家組等的總結[17]。設備采用奧林巴斯外徑2.8 mm電子支氣管鏡。肺泡灌洗：0.9%氯化鈉溶液1～2 mL/kg灌洗實變肺段或支氣管開口堵塞的肺葉段，回收率50%左右。

2 宏基因二代測序

肺泡灌洗液的存儲及運輸參考專家共識[6]。樣品外送廣州微遠基因科技有限公司，完成DNA和RNA雙程序測序。檢測RNA程序時，使用rRNA deletion probes試劑盒(微遠基因產品)去除宿主的核糖體RNA。實驗環節包括核酸提取、文庫構建、測序和信息分析。基于Illumina高通量測序平臺，涵蓋9945種細菌、6760種病毒、1551種真菌、144種分枝桿菌、107種支原體/衣原體及305種寄生蟲。目前臨床沒有統一的陽性評判標準，參考相關文獻[4, 8-9, 18-20]，本研究的陽性標準：1)在排除正常皮膚等菌群之后，相對豐度位于前5位的屬，每個屬又選前2位的種；2)細菌、真菌和病毒，當特異性序列數≥3 reads時判斷為陽性；對于寄生蟲，特異性序列數≥10 reads判讀為陽性。結核分枝桿菌復合群，特異性序列數≥1 reads，即判斷為陽性；3)有經驗的醫師討論符合臨床表現、影像學改變，排除可能定植、污染病例；4)針對性治療后，患兒病情改善。

3 其他實驗室檢查

與mNGS同時取材的肺泡灌洗液送廣東省婦幼保健院(廣東省兒童醫院)檢驗科、產前診斷遺傳醫學中心，完善傳統培養、病原核酸qPCR檢測(CMV、EBV、MP、TB、hEnV、RSV、BoCV、hRhV、AdV)。

注：CMV，巨細胞病毒cytomegalovirus；EBV，EB病毒EB virus；MP，支原體mycoplasma；TB，結核分支桿菌mycobacterium tuberculosis；hEnV，人腸道病毒human enterovirus；RSV，呼吸道合胞病毒respiratory syncytial virus；BoCV，博卡病毒boca virus；hRhV，人鼻病毒human rhinovirus；AdV，腺病毒adenovirus。

4 影像學檢查

廣東省婦幼保健院(廣東省兒童醫院)2名副主任醫師以上職稱影像學醫生對胸片、增強CT作出描述、診斷。

5 統計學處理

結 果

一、一般資料

(見表1)。

表1 一般資料

二、病原學資料

1 病原分類(見表2)。

表2 病原分類

2 mNGS病原分屬、混合感染(見表3)。

表3 mNGS病原分屬、混合感染

3 mNGS塑形性支氣管炎 人腺病毒7B型(3/5例)，人副流感病毒3型(2/5例)，乙型流感病毒(1/5例)。

4 mNGS兒童急性呼吸窘迫綜合征 人腺病毒7B型(2/2例)。

5 mNGS與傳統培養比較(見表4)。

表4 mNGS與傳統培養(細菌、真菌)比較(n)

6 mNGS與qPCR比較(見表5)。

表5 mNGS與qPCR(呼吸道病原9項)比較(n)

三、低氧組與非低氧組的單因素比較

1 一般資料

性別、年齡、體重、喘息、病程2周以上及彌漫性改變均無差異，P>0.05；a/APO2、PCO2>50mmHg及有創機械通氣例數存在差異，P<0.05(t=9.373，χ2=5.390，χ2=8.792)(見表1)。

2 mNGS分屬兩組均無差異，P>0.05(見表3)。

討 論

兒童重癥監護室(PICU)收治的支氣管肺炎病例，病情較重，可較短時間惡化致呼吸衰竭、兒童急性呼吸窘迫綜合征及膿毒癥等嚴重后果[12, 21-22]。本研究中重癥、病情遷延的病例占多數(表1)，其中影像學彌漫性改變、抗生素療效不佳及呼吸衰竭的，有迫切的診斷壓力。然而肺炎病因復雜，感染、免疫失調、腫瘤、氣道結構異常和系統性因素(神經、肌肉、循環及消化等)摻雜。相似的臨床表現，可能為混合感染，可能有非感染因素。例如CT呈彌漫性磨玻璃樣改變，原因可能為CMV等病毒感染、耶氏肺孢子菌感染、過敏性肺炎及肺泡蛋白沉著癥等。主治醫生的診斷思路常常是，先排查感染。確定病原體感染，包括直接證據、間接證據。直接證據包括病理、培養及核酸檢測，間接證據有特異性抗體檢測。有研究顯示使用傳統病原學檢測方法高達60%的病例無法明確病原體[2]。大量的檢測耗費時間，患兒可能延誤救治。病原微生物宏基因二代測序技術(mNGS)屬于核酸檢測，作為臨床病原學診斷的新方法，本研究將其應用于重癥監護支氣管肺炎兒童的肺泡灌洗液，探討其應用價值，從取材、病原學特征及診斷效能上，與傳統培養、qPCR比較。

首先，mNGS工作原理、流程不依賴培養，不像PCR預設感染立場。本研究重癥患兒只需要接受一次肺泡灌洗取材，標本量1.5到3毫升送檢，2到3天結果回報。mNGS可避免重癥患兒反復大量地取材，節省檢測項目和時間。

接著我們研究重癥監護支氣管肺炎兒童的病原學特征，(表2)顯示mNGS診斷病原分類：病毒多見(40/60例)，細菌(19/60例)、真菌(15/60例)及支原體(9/60例)感染亦有相當比例；(表3)顯示mNGS診斷混合感染：2種以上微生物感染31/60例，2類以上微生物感染20/60例。可見研究人群的病原譜寬廣。傳統培養的檢測范圍是細菌、真菌。qPCR的檢測范圍是預設的感染項目，本研究為呼吸道病原9項。可見傳統培養、PCR非廣譜，如希望擴大范圍，標本量、時間及經濟成本隨之升高。mNGS的檢測范圍是其最大的應用優勢，涵蓋了9945種細菌、6760種病毒、1551種真菌、144種分枝桿菌、107種支原體/衣原體及305種寄生蟲，尤其適用于排查混合、少見及難以培養的感染(例如表3的百日咳博德特菌屬、肺孢子菌屬)。mNGS不僅可辨別病原屬、種，還可分型。分型對抗感染治療、流行病學調查具有指導意義[23]。分屬水平，mNGS發現低氧組與非低氧組無差異(表3)，但分型時發現PB、PARDS的病例發生腺病毒7B型感染較多(3/5例、2/2例)。本研究病例收集于2019年4月至2019年10月。當時廣東存在腺病毒肺炎疫情，國家衛生健康委于2019年6月制定《兒童腺病毒肺炎診療規范(2019年版)》，指出人腺病毒7B型是2019年我國南方發病地區的主要流行株[24]。另外，病原微生物存在天然耐藥性(例如表3的念珠菌屬中，光滑念珠菌、克柔念珠菌對氟康唑天然耐藥；單胞菌屬中，嗜麥芽窄食單胞菌對碳青霉烯類抗生素天然耐藥[25])，mNGS診斷微生物屬種型，迅速幫助醫生選用合適的抗感染方案。

最后我們研究mNGS的診斷效能。對于細菌、真菌，傳統培養檢出率21.7%(13/60例)，mNGS為41.7%(25/60例)，高于傳統培養(χ2=5.188，P<0.05)。原因是傳統培養受病原體活性、數量、培養環境及抗生素使用等因素的影響。mNGS為核酸測序，則不受微生物活性、抗生素使用的影響。mNGS對厭氧菌、傳統培養困難的細菌、真菌更有優勢，所以檢出率更高。對于病毒、支原體及結核分枝桿菌，qPCR檢出率79.5%(35/44例)，mNGS檢出率63.6%(28/44例)，低于qPCR(χ2=13.49，P<0.05)。原因是工作原理的差異。qPCR使用特異性引物對目標核酸進行擴增后再檢測，而mNGS對目標核酸不經擴增直接檢測，而且檢出率與選擇的檢測深度有關，故qPCR對目標核酸更敏感。當mNGS檢測陽性時，有時使用qPCR對其進行驗證。mNGS的敏感性(假陰性問題)、特異性(假陽性問題)以及符合率如何？本研究以傳統培養、qPCR為金標準，mNGS與兩種方法比較(表4、5)，mNGS表現出較高的敏感性、特異性及符合率，尤其在與qPCR比較時【敏感性77.1%(95% CI 0.610～0.879)，特異性88.9%(95% CI 0.565～0.994)，符合率79.5%(35/44例)】。結果與首都醫科大學附屬北京朝陽醫院的成人呼吸道危重癥肺泡灌洗液的研究相近(敏感性77.8%，特異性70%[20])。mNGS假陰性的原因有：(1)病原的載量低于mNGS的檢測深度。mNGS的檢測深度是可調整的，從75bp的短序列到10000bp的長序列。深度越大，獲取序列越多，敏感性越高。(2)宿主、微生態的背景基因序列太高。有文獻指出，宏基因序列中超過99%為人體、微生態的基因序列，病原微生物僅占不到1%[26]。人體強烈免疫反應時，白細胞升高，取材樣品中人的基因序列更多。實驗室需應用去除人體基因序列的技術以富集病原體基因序列。(3)微生物具有厚膜壁。例如結核分枝桿菌，mNGS較難獲取核酸序列，需要應用破壁技術。可見，mNGS的假陰性能通過實驗室提高技術而減少，同時，臨床醫師如果預斷感染為厚壁膜的微生物，最好加上培養、PCR等方法，避免漏診。判讀mNGS結果時，尤其是細菌類微生物，需要注意假陽性的問題。因為呼吸道并非無菌，存在微生態，本研究建議mNGS的陽性標準綜合以下條件：(1)相對豐度、特異性序列數符合一定條件(相對豐度位于前5位的屬，每個屬又選前2位的種；細菌、真菌和病毒特異性序列數≥3 reads；寄生蟲特異性序列數≥10 reads；結核分枝桿菌復合群特異性序列數≥1 reads)。(2)排除常見的上/下呼吸道的微生態菌群(背景菌)[27-28]。(3)盡量采取DNA、RNA雙程序測序。(4)有經驗的臨床醫師討論，審視取材，結合臨床表現、影像、傳統檢驗結果及對應療效的評價。另外，有文獻提出宿主基因轉錄的改變[8]、病原核酸序列分布的彌散程度[29]及微生態多樣性的改變[30]，均有助于區分感染、定植、污染及背景菌，是mNGS有待研究的方向。

綜上，收治重癥監護室的支氣管肺炎兒童，需要短時間內排查混合、少見感染。肺泡灌洗液宏基因二代測序技術具有廣譜、花時較少、高診斷效能等優勢，適合危重兒童使用。