中性粒細胞明膠酶相關載脂蛋白在惡性胸腔積液中的診斷價值

肖偉迪 董佳慧 孫耕耘

惡性胸腔積液(MPE)是晚期癌癥患者常見的并發癥，其中肺癌轉移后形成的胸腔積液最為常見，約占30%。肺癌轉移到胸膜，在最新的肺癌TNM分期系統中被定義為M1a(IVA期)，出現MPE意味著惡性腫瘤預后不良[1]?；颊咴谑状卧\斷為MPE后的生存期(OS)為3～12個月，不同的腫瘤亞型對患者生存期有著重要影響。一般來說，肺癌所致MPE患者的平均生存期為4～7個月，預后最差[2-3]。

早期、準確地診斷MPE有助于改善患者的病情。然而，由于缺乏有效的篩查方法，MPE的診斷仍然具有挑戰性。臨床上常用的實驗室檢驗手段包括生化、免疫學、微生物學、分子和細胞等參數的評估。胸腔積液中生物標志物的定量檢測是其中重要的診斷方法，有助于病因的判斷。作為一種分泌蛋白，體液中可被檢測出的NGAL水平的升高已被證實與多種惡性腫瘤有關。這些發現表明NGAL可能是一種新的潛在的腫瘤生物標志物。

資料與方法

一、研究對象

從2019年10月至2020年7月，98例未確診的胸腔積液患者被納入本研究，所有胸腔積液均通過病史、臨床表現、胸腔積液生化或細胞學、細菌學檢查、胸膜活檢、內鏡檢查、經皮穿刺活檢確診，未接受任何手術、放化療、射頻消融、靶向等治療。研究方案經安徽醫科大學第一附屬醫院倫理委員會批準，并根據赫爾辛基宣言的最新版本進行。從醫療記錄和實驗室系統數據庫中提取臨床和實驗室數據。

在98例患者中，44例有MPE，其中肺腺癌29例，肺鱗癌2例，肺小細胞癌4例，乳腺癌2例，淋巴瘤2例。其余5例MPE患者未發現原發癌灶。以54例良性胸腔積液(BPE)為對照。其中包括結核性胸腔積液24例，肺旁胸腔積液22例，全身性疾病(漏出液)8例。

二、樣本的收集和分析

所有患者均接受標準胸腔穿刺術，在此期間收集胸腔積液樣品。將每個新鮮收集的胸腔積液樣品的一部分送至醫院檢驗科進行CEA和CYFRA 21-1分析以及其他生化分析。將每個樣品的另一部分在3000 r/min離心15分鐘，并將上清液在-80℃儲存直到分析，避免重復凍融循環。在分析之前，樣品被重新離心以避免基質效應。

三、 NGAL和腫瘤標志物的檢測

使用NGAL ELISA檢測試劑盒(Quantikine R&D，Minneapolis, USA)測定胸液NGAL水平，嚴格遵守制造商的說明。安徽醫科大學第一附屬醫院檢驗科使用電化學發光免疫法定量測定血清及胸液中CEA和CYFRA 21-1水平，還測量了血清及胸液細胞數、蛋白、蛋白、葡萄糖、乳酸脫氫酶(LDH)等水平。

四、統計分析

使用SPSS 25.0(Chicago, IL, USA)進行統計分析，偏態分布樣本數據通過中位數(M)和四分位數間距(Q)來表示，兩個獨立樣本間使用非參數Mann-Whitney U檢驗評估組間差異的顯著性。采用Pearson相關系數(R)計算和線性回歸分析評估變量之間的關系。繪制ROC曲線和曲線下面積(AUC)，以評估胸液NGAL、CEA和CYFRA 21-1的總體診斷性能。此外，我們使用Creaney等[4]推薦的方法評估了兩個或三個標記物共同區分MPE和BPE的能力。

結 果

一、患者的臨床特征

在該研究的98位患者中包括了44例MPE患者和54例非MPE患者，其中男性占63.27%(62/98)，女性占36.73%(36/98)，平均年齡為62.34歲。各組之間的年齡(P=0.563)，性別(P=0.317)差異無統計學意義(P>0.05)。(表1)列出了這98例患者的胸腔積液的病因。(表2)總結了所研究組的臨床特征以及主要實驗室檢查結果，MPE組和BPE組在胸液顏色和外觀、血清CEA和CYFRA21-1、胸液白細胞計數等方面均有統計學差異(P<0.05)。

表1 胸腔積液患者的病因

二、胸液NGAL、CEA和CYFRA 21-1的含量及診斷價值

MPE患者胸液中NGAL，CEA和CYFRA 21-1的含量顯著高于BPE患者(表3)。使用ROC曲線評估每種標記物的診斷性能(圖1，表4)。根據ROC曲線得出的診斷MPE的最佳截斷值：NGAL為78.24 ng/ml, CEA為2.43ng/ml, CYFRA21-1為22.56 ng/ml。當截斷值為78.24ng/ml時，NGAL診斷MPE的敏感度為61.36%，特異度為74.07%，AUC為0.71。CEA顯示最佳診斷性能，AUC為0.82。

表2 MPE組和BPE組血液、胸液標本的特征

表3 胸液中NGAL、CEA、CYFRA21-1的含量

我們還研究了MPE標記物不同組合的診斷性能(表4)。胸液CEA和NGAL組合對惡性胸腔積液診斷的敏感度為84.09%，特異度為70.37%，準確度為76.53%，AUC為0.84(圖1)。常規腫瘤標記物CEA和CYFRA 21-1組合的敏感度為65.91% ，特異度為85.96%，AUC為0.85；三種標記物的組合AUC為 0.86，具有最高的特異度88.89%。

圖1 評估胸液NGAL、CEA、CYFRA21-1診斷價值的ROC曲線

表4 胸液NGAL、CEA 、CYFRA21-1診斷價值(%)

討 論

胸腔積液是惡性腫瘤最常見的并發癥之一[5]，早期、準確地診斷MPE可提高識別原發性惡性腫瘤的能力，并盡快開始治療[6]。但是，目前的檢測方法對MPE診斷的靈敏度和準確性不高。現有研究表明，NGAL在多種惡性腫瘤的組織及體液中呈高表達，其升高可能與惡性胸腔積液有關[7]。目前在MPE中關于NGAL水平的研究較少，因此本研究開展了相關檢測試驗，研究重點在于評判NGAL水平與MPE的相關性是否足夠強，NGAL是否足以用作MPE的診斷性生物標志物。

中性粒細胞明膠酶相關載脂蛋白(NGAL)，又名LCN2或24p3，是一種分泌性糖蛋白，由178個氨基酸殘基組成。在正常生物體中，NGAL主要在中性粒細胞中表達，在巨噬細胞和脂肪細胞中也存在低穩態水平的NGAL[8]。目前的研究已經將NGAL與癌癥的發展和進展聯系起來[9]，NGAL有利于腫瘤細胞的增殖與存活，在肺癌中，NGAL可能通過激活核因子E2相關因子2 /血紅素加氧酶-1(Nrf2 / HO-1)途徑并誘導血紅素加氧酶-1和超氧化物歧化酶1的表達來防御氧化應激[10]，此外，NGAL還通過與特異性結合受體24p3R結合，增加細胞內鐵濃度，發揮促進腫瘤細胞增殖的作用[11]。NGAL的致癌作用還可能與NGAL/MMP-9復合物有關，NGAL/MMP-9對MMP-9的自我降解具有保護作用，從而使MMP-9在細胞外基質中具有較高的明膠溶解作用[12]。由于這一功能，NGAL可能促進癌癥的發展和轉移過程。最近的研究表明，在大多數癌癥類型中，高濃度的NGAL與疾病嚴重程度和低存活率有關[13-14]。

現有的少數關于胸腔積液中NGAL診斷效能的報道存在爭議。Gümüs等[15]首次在胸腔積液中檢測NGAL，指出血清和胸液NGAL水平可區別PPE(肺炎旁胸腔積液)與其他導致胸腔積液的原因(如心力衰竭、MPE和結核病)。血清NGAL水平比胸液NGAL水平具有更高的診斷價值，高于188 ng/mL的血清NGAL水平和高于210 ng/mL的胸液NGAL水平在區分PPE患者和非PPE患者方面非常有效(AUC分別為0.910和0.790)。Wu等[16]的研究報道，截斷值為169.9 ng/mL時，胸液NGAL對PPE診斷的敏感度高達92.6%，AUC為0.983，他們進一步應用NGAL鑒別復雜性(CPPE)和非復雜性肺炎旁積液(UPPE)，并發現CPPE中胸液NGAL水平明顯高于UPPE(P<0.001)。與上述研究結論不同的是，最近的一項在圣保羅大學醫院進行的回顧性研究顯示[7]，惡性積液(malignant effusion,ME)的NGAL濃度顯著高于非結核性感染性胸腔積液(nontuberculous infectious effusion,NTBIE)、結核性胸腔積液(TPE)和漏出液(TRANS)，NGAL診斷ME的敏感度、特異度分別為76.1%、77.5%，ACU為75.8%。

本研究觀察到MPE患者的胸液NGAL水平高于BPE患者，當與常規腫瘤標志物(如CEA和CYFRA 21-1)結合使用時，NGAL有助于MPE的診斷。NGAL本身對診斷MPE具有較低的敏感度(61.36%)和特異度(74.07%)，但聯合CEA具有較高的敏感度(84.09%)及診斷價值(AUC=0.84)。依據本研究結果，將NGAL與常規標志物(如CEA和CYFRA 21-1)結合使用可能更適合診斷MPE，這一初步發現支持運用多種生物標志物的組合以提高臨床應用價值。

本研究還比較了患有原發性支氣管肺癌(n=35)及其他類型惡性腫瘤(n=9)患者，未發現胸液中NGAL含量有顯著差異，此結果需在具有多中心的較大樣本中進一步證實。有證據表明，患有不同類型癌癥的癌癥患者血清中NGAL水平，可能有所不同[13, 17-19]。因此，進一步的研究擬收集多種類型腫瘤患者標本，分析NGAL對于不同癌癥相關MPE的鑒別是否有用。

由于我們的研究納入的MPE患者有限(n=44)，樣本中未涵蓋間皮瘤和其他轉移性癌癥相關的病例，NGAL水平是否與所有MPE病例相關尚未明確。因此，進一步的研究應擴大樣本量、增加分組，進一步評估其診斷價值。

結 論

胸液NGAL水平升高與MPE有關。NGAL與經典腫瘤標志物(CEA和CYFRA 21-1)聯合使用有助于提高現有手段對MPE診斷的能力，具有一定的臨床指導意義，未來仍需在更大更嚴格的研究中得到驗證和擴展。