下調SOAT1表達對食管癌增殖和轉移的影響

寧光耀，張仁泉，黃云龍

食管癌是全世界最常見的消化道惡性腫瘤之一，具有病死率高、男性多于女性等特點，其發病率和病死率均呈上升趨勢。盡管許多影響食管癌發生發展的危險因素已被證實，但其具體的機制尚未闡明。甾醇氧乙酰基轉移酶(sterol O-acyltransferase，SOAT)-1可催化細胞內游離膽固醇轉換成膽固醇脂類，并維持細胞內的膽固醇穩態。哺乳動物體內SOAT包含2個亞型：SOAT1和SOAT2，SOAT1是內質網的標記酶，廣泛表達于所有組織類型，而SOAT2僅在腸道和肝臟中表達。研究發現，SOAT1在多種腫瘤中的影響已被報道，其中包括肝細胞癌、腎透明細胞癌以及結腸腺癌。然而，目前尚無報道闡明SOAT1在食道鱗狀細胞癌中的作用。因此，該研究主要從細胞學實驗闡明SOAT1異常表達對食管癌細胞的增殖、遷移及侵襲的調節作用，為今后的臨床治療提供一定的基礎依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1

細胞株

選用的食管癌細胞株(KYSE 510、KYSE 450、KYSE 150和KYSE 30)和食道上皮細胞(Het-1a)均購自中國科學院細胞庫。

1.1.2

主要試劑和儀器

RPMI Medium 1640 basic培養基(美國Gibco公司)，無支原體新生牛血清(杭州四季青有限公司)，Lipofectamine 2000轉染試劑(美國ThermoFisher公司)，Transwell小室(美國Corning生物科技有限公司)，Cell Counting Kit -8(上海碧云天生物技術有限公司)，超敏ECL化學發光試劑盒(美國ThermoFisher公司)，SOAT1抗體(美國Abcam公司)，GAPDH抗體和辣根過氧化物酶標記二抗(北京中杉金橋公司)，Annexin V-FITC/PI雙染色試劑盒(美國BD Biosciences公司)，Takara 逆轉錄試劑盒、Real Time PCR試劑盒(北京Takara生物醫學公司)。2條SOAT1特異性siRNA均由上海吉瑪生物科技有限公司合成，靶序列分別為：CCCACUCAUUUGUCAGAGA，CUCUUCAUGUUCUUUGGAA。酶標儀(美國Bio-Tek公司)，流式細胞儀(美國BD生物科學有限公司)，化學發光圖像分析系統(上海天能科技公司)。

1.2 方法

1.2.1

細胞培養

采用含10%新生牛血清的RPMI 1640培養基，細胞培養箱的培養條件為5% CO、37 ℃。

1.2.2

siRNA干擾

當KYSE 30細胞處于生長指數期時，在6孔板中進行接種。待細胞生長至70%～80%時，按照《lipofectamine 2000操作說明書》進行siRNA轉染。分別取100 pmol /ml siRNA和3 μl lipofectamine 2000加入到2支含100 μl Opti-MEM培養基的1.5 ml離心管中混勻室溫放置5 min，將2支離心管內液體混勻室溫放置15 min，最后分別均勻加入到每個培養孔內。

1.2.3

細胞增殖檢測

在96孔板中接種KYSE30細胞，密度為5 000個/孔。經不同處理后，加入10 μl CCK-8溶液并混勻，繼續培養1.5 h后采用酶標儀檢測吸光度值。

1.2.4

劃痕實驗

當KYSE30細胞處于生長指數期時，按1×10個/ml的密度在6孔板中接種。24 h后換成含1%胎牛血清的RPMI 1640培養基，繼續培養12 h。采用200 μl 槍頭在培養孔底部劃出水平劃痕，并用PBS洗去漂浮細胞，用含1%胎牛血清的RPMI 1640培養基繼續培養。置于光學顯微鏡下拍照，經過不同轉染處理后，48 h再次進行拍照。

1.2.5

Transwell實驗

首先制備預鋪Matrigel膠的transwell小室，Matrigel膠和RPMI 1640培養基的比例為6 ∶1。選取經siRNA轉染48 h的細胞，調整細胞密度為1×10個/ ml。在上室內加入100 μl 細胞懸液，下室內加入600 μl 含10%胎牛血清的RPMI 1640培養基，繼續培養48 h。取出小室，放入4% 多聚甲醛溶液中室溫固定20 min，PBS洗滌后放入1%結晶紫染色缸內進行染色15 min，PBS洗滌后置于室溫干燥，擦去小室內膜上Matrigel膠和染色細胞，最后在顯微鏡下拍照。

1.2.6

流式細胞術

將KYSE 30細胞接種于6孔板中，分成對照(NC)組和siRNA-2組，觀察細胞凋亡情況。繼續培養48 h后，使用Annexin V-FITC/PI雙染色試劑盒對收集的細胞進行染色。用流式細胞儀檢測細胞凋亡，用Flow-jo軟件分析細胞凋亡情況。

1.2.7

Western

blot

組織或細胞采用含1% PMSF的RIPA裂解液進行裂解5 min后，在4 ℃環境下進行14 000 r/min離心。取清亮的上清液，并采用BCA試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)進行蛋白定量。取30 μg 蛋白液依次進行SDS-PAGE濃縮、分離并轉至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入一抗(1 ∶1 000)，在4 ℃條件下孵育過夜。洗滌3次后，加入二抗，室溫孵育1 h，洗滌后在化學發光圖像分析系統進行拍照。

1.2.8

mRNA提取與qRT

-

PCR

采用AxyPrep總RNA小量制備試劑盒(美國Axygen公司)進行RNA提取。然后，采用逆轉錄試劑盒將提取的RNA逆轉錄成cDNA。最后，采用Real Time PCR試劑盒進行相對定量檢測。SOAT1引物序列：F: TTTGCTGACGCTGCTGTAGAACC，R：AAAGGCTTCATTTACTTCCCACATTGC；GAPDH引物購于上海生工生物工程有限公司。

2 結果

2.1 食管癌組織中SOAT1蛋白及mRNA表達高于癌旁正常組織

收集9例食管癌患者的臨床資料及組織樣本。患者平均年齡為58～75(67.5±6.6)歲，其中男性6例，女性3例。術后病理診斷報告均為食道鱗狀細胞癌，其中低分化5例、中低分化3例、高分化1例。食管癌組織中SOAT1蛋白的表達高于癌旁組織(圖1A)，且SOAT1 mRNA 表達亦高于癌旁正常組織(圖1B)，差異有統計學意義(

t

=4.162，

P

=0.000 7)。

圖1 食管癌患者的配對癌及癌旁組織中SOAT1蛋白及mRNA表達水平

2.2 食管癌細胞系中SOAT1蛋白及mRNA表達高于食管正常上皮細胞

選取4株食管癌細胞系以及Het-1a。如圖2A示，SOAT1蛋白在4株食管癌細胞系內表達均不同程度高于Het-1a細胞。如圖2B示，4株食管癌細胞系內SOAT1 mRNA表達亦均高于Het-1a細胞且差異有統計學意義(

F

=85.72，

P

<0.000 1)。

圖2 SOAT1蛋白及mRNA在食管癌細胞及食道上皮細胞中的相對表達量

2.3 siRNA敲低KYSE30細胞內SOAT1蛋白及mRNA表達

如圖2所示，KYSE30細胞系內SOAT1蛋白及mRNA表達相對較高，因此后續細胞學實驗均采用KYSE30細胞系。如圖3所示，通過細胞轉染siRNA敲低細胞內SOAT1表達，結果顯示，與NC組比較，2條SOAT1特異性的siRNA-1/2均可以下調KYSE30細胞內SOAT1蛋白(圖3A)及mRNA(圖3B)表達且差異有統計學意義(

F

=42.80，

P

=0.000 3)。同時，本研究選取siRNA-2繼續開展功能學實驗。

圖3 轉染siRNA后KYSE30細胞內SOAT1蛋白及mRNA表達

2.4 降低SOAT1表達可減慢KYSE30細胞的增殖能力，增加細胞凋亡比例，促進凋亡相關蛋白表達

如圖4A示，降低SOAT1表達可抑制KYSE30細胞的生長速度，差異有統計學意義(72 h：

t

=5.573，

P

=0.005 1；96 h：

t

=10.73，

P

=0.000 4)；如圖4C示，負向調節SOAT1表達可增加KYSE30細胞的凋亡比例(0.62%

vs

6.49%)；Western blot結果也證實，敲低SOAT1表達促進了凋亡蛋白cleaved PARP和cleaved caspase-3的表達(圖4B)。

圖4 敲低SOAT1表達對KYSE30細胞增殖、凋亡細胞比例以及凋亡相關蛋白表達的影響 A：2組細胞增殖變化；B：2組細胞內凋亡相關蛋白表達水平；C：2組細胞內凋亡比率變化；與NC組比較：**P<0.01，***P<0.001

圖5 下調KYSE30細胞內SOAT1表達對其遷移及侵襲的影響×100

2.5 下調SOAT1表達可減弱KYSE30細胞的遷移和侵襲性

如圖5A、B所示，與NC組比較， SOAT1低表達組KYSE30細胞的遷移數目減少且差異有統計學意義(

t

=9.923，

P

=0.000 6)。如圖5C、D示， SOAT1低表達組KYSE30細胞的侵襲能力較NC組減弱(

t

=3.357，

P

=0.028 4)。

3 討論

正常細胞向惡性腫瘤細胞轉化包括體細胞突變、表觀遺傳改變、代謝重編程和細胞生長失控。其中代謝重編程已成為腫瘤生物學的研究熱點，關鍵代謝基因也成為癌癥發生發展中重要調控因子和潛在的治療靶點。SOAT1是一種變構酶，它可以利用多種甾醇(包括氧甾醇和植物甾醇等)作為底物和活化劑，其中膽固醇是最優的底物和活化劑。近年來，研究發現SOAT1不僅參與生酮途徑、異亮氨酸降解和解酮過程而且具有調控腫瘤增殖及耐藥的能力。研究發現，SOAT1是前列腺癌的潛在預后標志物之一，前列腺癌樣本中出現膽甾醇酯積累，體內動物模型證實降低SOAT1介導的膽甾醇酯積累可以抑制前列腺癌的生長和轉移。Martinez-Outschoorn et al發現在MDA - MB - 231細胞中上調SOAT1基因，可顯著提高乳腺癌的生長和轉移能力。與此同時，在結直腸癌和肺癌中，SOAT1亦可促進癌細胞的增殖以及轉移。

為探究SOAT1對食管癌是否具有同樣調控作用，本研究收集了新鮮的食管癌組織，與正常食道組織比較，癌灶中SOAT1蛋白和mRNA表達上升。接下來，敲低SOAT1表達可以減慢食管癌細胞的增殖速度，促進其凋亡，并抑制其遷移及轉移能力，這與Geng et al研究結果類似。然而，在腎細胞癌中，SOAT1相對低表達組患者具有更短的總生存期和無病生存期，且體外實驗發現過表達SOAT1基因抑制腎癌細胞的生長及遷移能力。本研究與Geng et al的研究結果相反，這有可能與納入實驗的細胞系類型有關。鹽酸Nevanimibe是SOAT1的抑制劑之一，體外實驗顯示，低劑量可抑制降低腎上腺激素生成，高劑量可引起腎上腺皮質細胞凋亡。一項包含63例腎上腺皮質癌患者的多中心的臨床I期試驗發現，鹽酸Nevanimibe的最大耐受安全計量為6 000 mg/75 kg，但是研究中尚未發現任何完全緩解或部分緩解的跡象。因此，對于鹽酸Nevanimibe是否在食管癌臨床中具備安全性和有效性將值得進一步探究。綜上所述，敲低SOAT1表達可負向調控食管癌細胞增殖、遷移以及侵襲能力，這為今后的SOAT1抑制劑臨床治療提供了一定理論依據。