胎牛肺間充質干細胞對脂多糖介導小鼠急性肺損傷治療的研究

殷佳輝，王 琪，孫宇辰，朱曉峰，喬 峰，鄒志田

（1.佳木斯大學附屬第一醫院心胸外科，黑龍江 佳木斯 154002；2.佳木斯大學基礎醫學院，黑龍江 佳木斯 154002；3.佳木斯傳染病醫院檢驗科，黑龍江 佳木斯 154002；4.佳木斯大學生命科學學院，黑龍江 佳木斯 154002）

間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一種具有自我更新能力和多向分化能力的多能干細胞[1-4]。病理狀態下，間充質干細胞可以在炎癥介質的刺激下，通過遷移和歸巢作用參與損傷部分的修復[5]，也可以通過靜脈或局部注射路徑遷移到損傷部位，進而發揮一系列生物效應[6]。因MSCs表面表達低水平Ⅰ型白細胞抗原（HLA），不表達Ⅱ型主要組織相容性抗原（MHC-Ⅱ）和T細胞共刺激分子，具有低免疫原性，可為異體MSCs治療提供理論依據[7]。急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）是急性肺損傷（ALI）最嚴重的形式，病死率較高，目前尚無特異有效的治療措施[8]，因此研究的重點仍是尋找有效的治療方法。本研究對胎牛肺間充質干細胞（lung-derived mesenchymal stem cells，LMSCs）進行分離培養及鑒定，并通過腹腔注射LPS造小鼠急性肺損傷模型，然后將LMSCs移植到急性肺損傷的小鼠體內，觀察LMSCs對急性肺損傷治療作用，為異源干細胞進行臨床治療提供實驗理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料來源 本實驗對象3個月齡胎牛購自中國農科院家畜實驗基地，6周齡雄性小鼠購自北京華阜康生物有限公司。LPS購自北京索萊寶科技有限公司，α-MEM培養基、胎牛血清(FBS)、山羊血清、谷氨酰胺購自美國GIBCO公司；胰蛋白酶(Trypsin 1∶250)、Triton X-100IV型膠原酶、PI購自美國Sigma公司；多聚甲醛和青鏈霉素購自北京化工廠；小鼠抗?？贵w購自Abcam公司產品；FITC標記兔抗小鼠二抗購自中杉金橋；RNA提取試劑盒TRI reagent、反轉錄試劑盒和extap酶購自TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 胎牛LMSCs的分離培養 取3月齡流產胎牛肺臟，在準備間初步消毒后移至細胞間無菌操作臺內，連同取樣工具一同紫外照射15 min，剖開胎牛胸腔，完整取出胎牛肺臟至培養皿內，然后用無菌眼科鑷子、眼科剪緩慢剝離胸膜，將肺組織及支氣管用PBS反復沖洗10遍，去除血細胞等雜質，將清洗干凈的肺組織及支氣管剪成約1～3 mm2織碎塊，轉移至新養皿中，加入10 ml 0.2%Ⅳ型膠原酶，移至37 ℃的5% CO2培養箱中酶消30 min～1 h，直至組織出現勻漿時取出，終止消化，過篩，離心，重懸，制單細胞懸液，接種到新皿，CO2培養箱培養，標記P0代，定期換液當細胞達90%融合時可細胞傳代，傳代比例為1傳2。

1.2.2 胎牛肺LMSCs的生長曲線 選取P5、P10及P15代LMSCs，以1.0×104個/ml密度接種到24孔板培養，取對數生長期LMSCs用血球計數板進行細胞計數。

1.2.3 RT-PCR鑒定 登錄NCBI網站，檢索獲取LMSCs基因序列并設計引物（表1），對LMSCs進行基因學鑒定。

表1 LMSCs基因引物序列

1.2.4 免疫熒光鑒定 取P5代純化后的LMSCs，LMSCs生長達皿底70%左右時棄舊培養基，PBS反復沖洗，4%多聚甲醛固定20 min，0.25%Triton X-100通透10 min，PBS漂洗，10%山羊血清阻斷非特異性抗體，加一抗（鼠抗牛CD29、CD44、CD73、CD166）避光孵育1 h，PBS漂洗，滴加FITC標記兔抗鼠IgG二抗30 min，PBS漂洗后DAPI染色1 h，加少量PBS移至共聚焦顯微鏡下觀察。

1.2.5 動物模型準備 準備72只雄性小鼠，隨機分為3組，標記為對照組、損傷組（LPS組）及治療組（LPS+LMSCs組），小鼠需進行2周適應性飼養。對照組行腹腔注射生理鹽水，劑量為10 mg/kg，損傷組組行腹腔注射LPS（10 mg/kg），治療組先行腹腔注射LPS后立即給予移植LMSCs，移植密度1×106/皿。在每組中設置3個時間節點：6、24、48 h處理小鼠，每個時間節點設置3組平行組。

1.2.6 小鼠模型ELISA檢測 采血管收集小鼠血清，在2 ℃～8 ℃環境下靜置1～2 h，3000 r/min離心15 min，取上清液備ELISA檢測。

1.3 統計學方法 利用GraphPad Prism 8.0軟件進行數據分析并繪制圖表。計量資料以（）表示，組間比較采用Student’st檢驗，多組間比較采用Oneway ANOVA with Tukey’s post hoc檢驗。當P＜0.05時表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 胎牛LMSCs的形態觀察 利用倒置顯微鏡觀察，采用酶消法及貼壁法分離培養出的貼壁生長的LMSCs形態，可見原代初期細胞生長緩慢成團生長，P3以后細胞形態整體穩定，立體感減弱，細胞多呈長梭形或紡錘形，核質比大，邊緣不規則。胎牛肺間充質干細胞至少可傳至15代以上，P15以后生長速度減緩，細胞形態出現扁平不規則樣生長。研究證明體外分離、培養的胎牛肺間充質干細胞在適宜的培養條件下可以增殖并維持干細胞生長特性，見圖1。

圖1 LMSCs的形態學觀察（×40）

2.2 生長曲線測定 利用血球計數板對P5、P10、P15的LMSCs進行細胞計數，由生長曲線可見LMSCs增殖均依次經歷潛伏期、對數生長期及平臺期。潛伏1～2 d后細胞增殖迅速，約7 d增殖減慢進入平臺期。群體倍增時間隨代次增高而延長?？紤]細胞增殖速度與細胞活力相關，本實驗后期選用純化后的P5代細胞進行LMSCs的移植治療，以期最佳治療修復作用，見圖2。

圖2 LMSCs生長曲線

2.3 RT-PCR檢測表面標記物 經RT-PCR鑒定，細胞表達CD29、CD44、CD73、CD166，不表達CD31，證明分離培養的細胞確定是LMSCs，見圖3。

圖3 LMSCsd的RT-PCR檢測

2.4 免疫熒光檢測表面標記物 LMSCs陽性表達CD29、CD44、CD73和CD166，證明所分離培養的細胞為LMSCs，見圖4。

圖4 LMSCs表面標記熒光表達（×40）

2.5 病理學切片觀察 鏡下觀察對照組小鼠肺泡壁結構完整，肺泡間質無滲出大小相近，存在正常的肺泡結構，無炎癥細胞出現在管壁及周圍，無膠原蛋白沉淀。損傷組小鼠肺組織出現大面積肺泡結構受損，大多數正常肺泡結構消失，肺泡腔改變可見變形閉塞，大量炎癥細胞浸潤，結構變性和異常的膠原蛋白沉淀，損傷作用時間越長，損傷程度加重。治療組小鼠在LMSCs移植治療后觀察肺損傷病變面積和損傷程度較LPS組下降，可見炎癥細胞浸潤減少、間質有所增厚及膠原少量沉積，肺切片更接近于正常肺組織肺泡形態，見圖5。

圖5 小鼠急性肺損傷模型HE染色病理學改變（×40）

2.6 ELISA血清檢查結果分析 損傷組6、24、48 h血清TNF-α、IL-4、IL-6水平高于治療組和對照組，且治療組高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖6。

圖6 小鼠模型ELISA血清學檢查結果

3 討論

目前MSCs已從骨髓、脂肪組、臍帶血織等組織中成功分離并用于相關動物實驗及臨床試驗當中，但鮮有LMSCs用于ALI治療的研究報道，本實驗成功從3個月胎齡牛肺中分離出LMSCs，在體外環境培養過程中，當細胞傳至第P5代，已經基本獲得純化的LMSCs。低代次的間充質干細胞生殖速度較快，隨著代次的增加，增殖速度逐漸降低。低代次的LMSCs細胞形態穩定，多呈紡錘形或長梭形，隨著培養代次的逐漸升高，LMSCs的形態可見分叉樣等改變。在細胞傳至P15代以上時，生長速度逐漸放緩，高代次LMSCs生長活力下降。通過RT-PCR和免疫熒光化學鑒定手段對LMSCs進行鑒定，LMSCs表達基因CD29、CD44、CD73、CD166，不表達CD31，證明本實驗通過體外分離培養技術得到的目的細胞是LMSCs，且其保持間充質干細胞的生物學特性。

急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）是急性肺損傷（ALI）最嚴重的形式，肺部的感染性疾病尤其是細菌性肺炎是ARDS最常見的病因。肺炎進展過程中，TNF-α、IL-4及IL-6等因子釋放，促進大量中性粒細胞滲出聚集在肺泡周圍，激活并釋放活性氧、蛋白酶、白三烯等介質，進一步加重損傷。本研究結果顯示，損傷組6、24、48 h血清TNF-α、IL-4、IL-6水平高于治療組和對照組，且治療組高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。有研究發現[9]，角質細胞生長因子7（KGF-7）在內皮細胞再生和損傷修復中具有重要作用，可減輕ALI動物模型的肺泡水腫。過表達KGF-7的MSCs改善了微血管通透性，抑制了TNF-α 等促炎因子的釋放，保護正常肺組織。IL-6可加劇肺部損傷，研究表明[10,11]，其作用機制是參與中性粒細胞在肺部的聚集，而TNF-α 具有促進IL-6分泌的作用，LMSCs通過抑制TNF-α 促炎因子的釋放，間接抑制IL-6的分泌，從而達到降低肺部炎癥反應的效果。IL-4可刺激肺內成纖維細胞增生，引起肺纖維化[12]。本研究中治療組小鼠IL-4水平較損傷組降低，降低了肺纖維化程度，起到了保護肺組織的作用。目前已有3項已完成的MSCs治療ARDS的臨床試驗，一項干細胞來源是異體脂肪來源的MSCs[13]，其余兩項是骨髓來源的MSCs[14，15]，但MSCs的最佳來源、合理劑量、給藥時間及給予方式仍無統一標準，如何進一步優化MSCs的療效仍是未來研究的重點。

總之，胎牛LMSCs在體外培養體系中可以穩定的保持其生物學特性，低代次LMSCs具有良好的增殖活性及分泌細胞因子的能力，可以有效降低LPS誘導的小鼠急性肺損傷血清中TNF-α 水平，參與調控IL-4、IL-6的分泌及免疫應答作用，提示胎牛LMSCs對急性炎性反應有一定治療作用。