單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷酯對魚藤酮誘導(dǎo)的大鼠中腦神經(jīng)元細(xì)胞的保護(hù)作用

蔣暐卿

（上海市奉賢區(qū)古華醫(yī)院老年科，上海 201499）

帕金森病（Parkinson's disease，PD）是常見的老年性神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，其主要發(fā)病機(jī)制是黑質(zhì)紋狀體部多巴胺能神經(jīng)元的變性、凋亡。目前隨著老齡化進(jìn)程的加劇，帕金森病患病人群在逐年增多，現(xiàn)階段帕金森病的治療以左旋多巴替代治療為主，雖然能一定程度上減緩病程的發(fā)展但最終仍無法有效的阻止病情的最終結(jié)果。因此開發(fā)能有效的延緩病情發(fā)展甚至阻斷病程的藥物已相當(dāng)緊迫。單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷酯是一種神經(jīng)營養(yǎng)劑，目前已廣泛的應(yīng)用于腦卒中的治療中，它可以促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)的生長、分化，同時可以增強(qiáng)神經(jīng)生長因子的活性，從而起到修復(fù)中樞神經(jīng)的效果[1]。也有研究[2]認(rèn)為神經(jīng)節(jié)苷酯的保護(hù)神經(jīng)、維持神經(jīng)元活性的能力在對于帕金森病的治療方面也有一定的作用。基于此，本研究通過魚藤酮建立帕金森細(xì)胞模型，觀察單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷酯對多巴胺細(xì)胞的保護(hù)作用，并探討其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及材料 雌性Sprague-Dawley（SD）大鼠24只，由中國科學(xué)院上海實驗動物中心提供。DF12/DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液、胎牛血清、胰蛋白酶、青霉素、鏈霉素、B27（Gibico，美國）；MTT、Hoechst 33258（碧云天生物技術(shù)有限公司）；異硫氰酸熒光素（FITC）和四甲基異硫氰酸羅丹明（TRITC）（Sigma，美國），加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗鼠抗體（cell signaling，美國）；ECL顯色試劑盒（Thermo，美國）；魚藤酮（Sigma，美國）；單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷酯；酶標(biāo)儀（Thermo，美國）；倒置熒光顯微鏡（IX81，Olympus，日本）。

1.2 動物模型制作及分組 將24只SD大鼠隨機(jī)分成隨機(jī)分成正常對照組、魚藤酮組、GM1對照組及GM1治療組，各6只。正常對照組不予以任何處理，魚藤酮組從實驗第一日起，每日上午于大鼠背部皮下注射魚藤酮1.5 mg/kg，GM1治療組從實驗第一日起，每日上午于大鼠背部皮下注射魚藤酮1.5 mg/kg，15 min后腹腔注射GM1 20 mg/kg，GM1對照組從實驗第一日起，每日上午腹腔注射GM1 20 mg/kg。連續(xù)注射1周，觀察各組大鼠的反應(yīng)情況。

1.3 中腦原代神經(jīng)元培養(yǎng)、處理 經(jīng)過1周處理后，將各組SD大鼠以10%水合氯醛麻醉，在顯微鏡中去軟腦膜，分離腹側(cè)中腦，剪碎，以0.05%胰蛋白酶室溫消化10 min，期間不斷振蕩；使用含有10%胎牛血清的DF12/DMEM培養(yǎng)液終止反應(yīng)，輕柔吹散10次/ml，靜置3 min取上清細(xì)胞懸液，以1200 r/min離心5 min，去上清，沉淀加入完全培養(yǎng)基。經(jīng)臺盼藍(lán)染色活細(xì)胞計數(shù)，以1.5×105/cm2的密度種入預(yù)先包被有D-多聚賴氨酸，并且加入完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)板中，置37 ℃、CO2培養(yǎng)箱12 h后更換為無血清培養(yǎng)基（DF12含2%B27，青霉素和鏈霉素各50 U/ml），體外培養(yǎng)7 d，并按照A組：正常對照組；B組：魚藤酮模型組；C組：GM1治療組；D組：GM1對照組進(jìn)行分組，用于后續(xù)實驗。

1.4 MTT法檢測細(xì)胞存活率 于96孔板中加入各組經(jīng)過不同處理后的原代神經(jīng)元培養(yǎng)液，每孔加入MTT液至終濃度為5 mg/ml，加入無細(xì)胞孔作為空白對照；37 ℃培養(yǎng)3 h后，吸除培養(yǎng)液，加入150 μl的DMSO振蕩混勻。在酶標(biāo)儀上以波長560 nm和參比波長630 nm檢測每孔光密度（D）值，細(xì)胞存活率=[（實驗組D值-空白組D值）-（對照組D值-空白組D值）]/（對照組D值-空白組D值）×100%。

1.5 免疫熒光染色 接種在玻片上的原代培養(yǎng)神經(jīng)元經(jīng)4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗3×5 min，以0.2%Triton-X-100 4 ℃孵育12 min，PBS洗3×5 min，用1%山羊血清封閉液孵育30 min，之后加入一抗：兔抗TH抗體（1:200）4 ℃孵育過夜，PBS洗4×5 min，加入FITC（1:500）和TRITC標(biāo)記（1:1000）的二抗混和液，室溫下避光孵育3 h，去除二抗孵育液，加入Hoechst 33258染核50 s（1:300），PBS洗4×5 min，之后加入抗熒光淬滅劑，用激光共聚焦顯微鏡顯像，熒光強(qiáng)度利用Image-Pro Plus軟件分析。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)以用SPSS 17.0軟件包分析，計量資料采用（）表示，行單因素方差分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠行為學(xué)表現(xiàn) 各組大鼠在實驗開始前均反應(yīng)靈敏，攝食正常，無明顯異常表現(xiàn)。正常對照組大鼠和GM1對照組大鼠在整個實驗過程中無明顯行為學(xué)無異常改變。魚藤酮組在實驗第1天注射魚藤酮約60 min后5只大鼠出現(xiàn)行走緩慢、步態(tài)不穩(wěn)癥狀，第3天3只大鼠均出現(xiàn)進(jìn)食減少、豎尾、步態(tài)不穩(wěn)加重、行走困難等現(xiàn)象，第4天5只大鼠均出現(xiàn)上述行為學(xué)表現(xiàn)，并隨著時間推移大鼠的表現(xiàn)越來越明顯。GM1治療組大鼠在實驗第1天無明顯異常行為學(xué)改變，第3天2只大鼠出現(xiàn)活動減少、攝食減少，第4天相同的2只大鼠出現(xiàn)肢前抬舉困難伴震顫、活動減少、攝食減少，但無明顯豎尾、步態(tài)不穩(wěn)，第7天相同的2只大鼠仍出現(xiàn)前肢抬舉伴震顫、活動減少，但癥狀較前無明顯加重，1只大鼠出現(xiàn)活動減少，但無其它行為學(xué)改變，剩余2只大鼠無明顯行為學(xué)改變。

2.2 各組細(xì)胞存活率比較 MTT實驗顯示：正常對照組細(xì)胞存活率為96.64%，魚藤酮組細(xì)胞存活率為48.51%，GM1治療組細(xì)胞存活率為76.58%，GM1對照組細(xì)胞存活率為94.82%。單因素方差分析顯示，魚藤酮組細(xì)胞存活率低于正常對照組、GM1對照組，GM1治療組細(xì)胞存活率低于正常對照組、GM1對照組，高于魚藤酮組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；正常對照組與GM1對照組細(xì)胞存活率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖1。

圖1 各組細(xì)胞存活率比較

2.3 免疫熒光染色結(jié)果 TH免疫組化染色顯示，正常對照組和GM1對照組神經(jīng)元形態(tài)無損傷，神經(jīng)元突觸無損傷；魚藤酮組TH陽性神經(jīng)元數(shù)量減少，神經(jīng)形態(tài)也嚴(yán)重?fù)p傷，GM1保護(hù)組TH陽性神經(jīng)元的形狀及突觸的數(shù)目長度較魚藤酮組改善。TH陽性神經(jīng)元計數(shù)統(tǒng)計顯示：正常對照組TH陽性細(xì)胞存活率為99.86%，魚藤酮組TH陽性細(xì)胞存活率為46.54%，GM1保護(hù)組TH陽性細(xì)胞存活率為74.83%，GM1對照組TH陽性細(xì)胞存活率為103.65%，見圖2。

圖2 免疫熒光染色結(jié)果

3 討論

魚藤酮是一種由天然植物魚藤中提取的脂溶性物質(zhì)，并于上世紀(jì)40年代起被廣泛的當(dāng)作殺蟲劑在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中使用，其具有很強(qiáng)的脂溶性，能輕易的通過血腦屏障，進(jìn)入腦組織內(nèi)的線粒體中，選擇性的阻斷鐵硫簇N2與泛醌Q的作用從而抑制線粒體呼吸鏈，產(chǎn)生細(xì)胞毒性，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。流行病學(xué)研究顯示，長期接觸魚藤酮的人群中其患PD的風(fēng)險明顯高于普通人群[3]。實驗顯示[4]，魚藤酮能使大鼠可出現(xiàn)類似PD的癥狀，而大鼠黑質(zhì)區(qū)的多巴胺神經(jīng)元則出現(xiàn)大量的死亡，殘存的神經(jīng)元類內(nèi)出現(xiàn)類似路易小體的包涵體結(jié)構(gòu)。說明魚藤酮從流行病學(xué)角度和動物實驗?zāi)Ｐ徒嵌染芎芎玫哪M帕金森病的發(fā)生，因此其已被廣泛用于制作PD模型的試劑。

本研究以魚藤酮制備PD大鼠模型，發(fā)現(xiàn)魚藤酮組大鼠明顯出現(xiàn)類似帕金森的行為學(xué)表現(xiàn)，而通過MMT方法檢測發(fā)現(xiàn)魚藤酮組大鼠中腦神經(jīng)元細(xì)胞出現(xiàn)凋亡，同時通過免疫熒光法發(fā)現(xiàn)在魚藤酮組中，經(jīng)過TH免疫組化染色的多巴胺能神經(jīng)元在形態(tài)上出現(xiàn)損傷。

GM1是一種由單個唾液酸殘基和4個己糖基構(gòu)成的鞘糖脂，主要分布于神經(jīng)細(xì)胞的細(xì)胞膜內(nèi)，它具有保護(hù)、營養(yǎng)神經(jīng)元細(xì)胞以及促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞軸突和突觸生長等多種作用。在神經(jīng)營養(yǎng)方面，GM1主要通過把跨膜絡(luò)氨酸激酶受體A（TrkA）磷酸化將其激活，從而激活下游多種目標(biāo)蛋白，發(fā)揮其生物學(xué)作用對神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行營養(yǎng)，促進(jìn)受損的神經(jīng)元進(jìn)行生長，同時它還能誘導(dǎo)神經(jīng)營養(yǎng)因子（NT）家族的分泌，而分泌后的NT則可以通過激活神經(jīng)元本身的Trk受體，從而進(jìn)行神經(jīng)營養(yǎng)及促進(jìn)神經(jīng)元細(xì)胞的生長。在抗細(xì)胞氧化方面和細(xì)胞毒性方面，GM1可以通過阻止Ca2+內(nèi)流，降低自由基濃度，防止膜脂質(zhì)水解，抑制細(xì)胞色素C的活性和興奮性氨基酸及花生四烯酸等的毒性作用，從而起到保護(hù)細(xì)胞作用[2]。在對抗細(xì)胞凋亡方面，GM1可以通過抑制α-突觸核蛋白的異常聚集，阻斷其所導(dǎo)致的氧化應(yīng)激等反應(yīng)，從而起到抗細(xì)胞凋亡的作用[7]。本研究發(fā)現(xiàn)，在經(jīng)過GM1治療后帕金森大鼠的行為學(xué)較魚藤酮組改善，這與Forsayeth J等[8]的研究一致；同時，GM1治療組中大鼠中腦神經(jīng)元細(xì)胞的存活率較魚藤酮組上升，進(jìn)一步通過TH免疫組化染色后發(fā)現(xiàn)經(jīng)過GM1保護(hù)后TH陽性神經(jīng)元的形狀及突觸的數(shù)目長度較魚藤酮組改善，這更為直觀的說明GM1可以有效的抑制魚藤酮導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡，起到保護(hù)神經(jīng)元的作用。

綜上所述，GM1可緩解魚藤酮所誘導(dǎo)的PD大鼠行為學(xué)改變，并通過營養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞、抗細(xì)胞氧化等作用減少細(xì)胞模型中神經(jīng)元細(xì)胞的損傷及變性，對神經(jīng)元細(xì)胞有一定的保護(hù)作用。