PGS/SF小口徑人工血管性能研究及體外細胞共培養

文/劉月

心血管疾病是世界上最普遍的疾病之一，腦血管、心血管和外周血管系統中血管直徑大多數小于6 mm[1]。

PGS有良好彈性和熱穩定性，回彈性在99.5%以上，但是PGS的力學性能較低，降解速率較慢[2-3]，PGS到達一定溫度后會發生固化，可以通過調節固化溫度和固化時間來提高其力學性能。除此之外，還可以與其他材料復合來提高其機械性能。

本文是之前研究的延續，進一步優化了PGS/SF小口徑人工血管的制備條件，并對其形貌及機械性能進行了表征，同時在PGS/SF樣品膜上開展HUVECs和VSMCs體外細胞共培養實驗。

1 實驗

1.1 實驗材料

聚癸二酸甘油酯（PGS），家蠶生絲，六氟異丙醇（C3H2F6O），聚環氧乙烷（PEO），胰蛋白酶（EDTA），HUVECs，VSMCs，DMEM高糖培養基，胎牛血清（FBS），雙抗，二甲基亞砜（DMSO），二乙酸熒光素（FDA），戊二醛（C5H8O2）。

1.2 實驗儀器

靜電紡絲機（長沙納儀儀器科技有限公司），CO2培養箱（上海一恒科學儀器有限公司），臺式電鏡（日立公司），全自動酶標儀（Bio-Tek公司），激光共聚焦顯微鏡（A1R-si，Confocal Microscope公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 PGS熱性能研究樣品制備

1.3.1 .1 PGS預聚物的合成

將20.225 g癸二酸和9.209 g丙三醇加入到三頸燒瓶中，在三頸燒瓶中通入氮氣并置于125℃油浴鍋中加熱攪拌2天后得到PGS預聚物。放入燒杯中冷卻至室溫，在4-8℃下密封保存備用。

1.3.1 .2 PGS固化方法

取適量的PGS放入真空干燥箱中，分別設置120、140、150、160℃對PGS預聚物進行固化，固化時間為24 h。用差示掃描量熱儀（DSC）對PGS預聚物和固化后的PGS進行分析。

1.3.2 PGS/SF小口徑人工血管的制備

稱取0.63 g PGS預聚物和0.27 g SF膜放入帶有磁力攪拌子的燒杯中，加入定量的六氟異丙醇（HFIP）配制質量分數為9%（w/w）的紡絲液。紡制膜及管狀樣品。靜電紡絲參數為：電壓為13.5 kV，接收距離為12 cm，流速為2 mL/h，轉速500 rpm，固化溫度為150℃。通過掃描電鏡、動態表面張力儀觀察PGS/SF小口徑人工血管材料的微觀形貌和吸濕性。通過萬能材料試驗機和定制的模具對固化后PGS/SF小口徑人工血管材料進行徑向拉伸測試。依據式（1-1）、式（1-2）計算PGS/SF小口徑人工血管的斷裂強度和斷裂伸長率。

1.3.3 細胞培養及接種

將PGS/SF樣品浸入到VEGF，在4℃冰箱中過夜。滅菌后將PGS/SF膜浸泡在培養基中并置于培養箱中過夜，細胞計數后將HUVECs稀釋至5×104 cell/mL。吸取1 mL接種到24孔板中的PGS/SF膜上和爬片上；吸取200 μL接種到96孔板中的PGS/SF膜上和空白板上。

將VSMCs稀釋至1×106 cell/mL。吸取100 μL接種到24孔板中的PGS/SF膜上和爬片上，3 h后，再加入900 μL培養基；吸取20 μL接種到96孔板中的PGS/SF膜上和空白樣上，3 h后，再加入180 μL培養基。

1.3.4 HUVECs和VSMCs細胞共培養

先將HUVECs接種到PGS/SF膜上進行培養，1 d后將膜翻轉朝下，用PGS/SF膜代替細胞小室中的Transwell膜，然后放入至12孔細胞小室和24孔細胞小室中，再在膜上接種VSMCs，3 h時后再在膜上加入培養基（細胞接種方式同（1.3.3），共培養時天數按照VSMCs的天數計算）。

1.3.5 統計學方法

采用SPSS軟件對試驗結果進行統計分析，用Origin作圖。結果以平均值±標準差（SD）表示，采用方差分析和t檢驗計算數據的顯著性差異。P＜0.05時記為有顯著差異（*），P＜0.01時記為有極顯著差異（**）。

2 實驗結果與討論

2.1 PGS DSC分析

隨著PGS的固化和固化溫度的升高，PGS的熔融溫度和結晶溫度逐漸降低，第二次升溫的結晶溫度低于第一次的結晶溫度。這是因為隨著固化溫度的升高，PGS結晶逐漸轉化為凝膠，該處的結晶峰主要是PGS中的凝膠部分引起的，PGS的結晶溫度隨著凝膠的量的增多而下降。在高溫區域，即在75-105℃出現熔融峰，說明在高溫區熔融峰在凝膠熔融曲線上仍部分存在[4]。

2.2 PGS/SF小口徑人工血管性能研究

2.2.1 PGS/SF形貌分析

圖1為不同固化溫度下的PGS/SF小口徑人工血管微觀圖像，從圖中可以看出，材料中的纖維隨機排列，隨著溫度的升高，纖維的孔隙逐漸減少。

2.2.2 接觸角

120℃固化溫度下的樣品接觸角為77.7°，具有親水性。從130℃開始，材料表面的接觸角開始大于90°，具有疏水性。由微觀形貌分析可知，隨著固化溫度的升高，材料表面的孔隙逐漸減少。且PGS的親水性不足，隨著溫度的升高，PGS熔融逐漸覆蓋在SF纖維表面，導致材料表面的疏水性逐漸增強。

2.2.3 徑向拉伸性能

將之前的制備工藝進行優化，即將靜電紡絲后的小口徑人工血管立即放入到真空干燥箱中，并提高其固化溫度，其力學性能得到提升。如圖3所示，隨著固化溫度的升高，斷裂強度和斷裂伸長率都有所提高，與之相反，楊氏模量隨著固化溫度的升高而降低。120℃和130℃固化后的PGS/SF小口徑人工血管的斷裂強度遠遠低于人內乳動脈斷裂強度（3.1 MPa）[5]，而140℃-160℃固化溫度后小口徑人工血管的斷裂強度高于人內乳動脈斷裂強度。通過以上研究表明PGS/SF小口徑人工血管固化溫度大于130℃能得到更好地力學性能。

從徑向拉伸性能的研究中可以看出，固化溫度為150℃的小口徑人工血管的斷裂強度略低于160℃，但是其斷裂伸長率是高于160℃的，所以我們最終選擇固化溫度為150℃作為小口徑人工血管的制備條件。

2.3 細胞共培養

2.3.1 掃描電鏡觀察細胞形態

HUVECs呈鋪路石狀黏附在PGS/SF材料上，HUVECs在2，4，8天的細胞數量隨著培養天數的增加而增加，證明PGS/SF材料有利于HUVECs的黏附和增殖。

VSMCs在PGS/SF材料上呈長梭形，VSMCs在PGS/SF材料上的細胞數量隨著培養天數的增加而增加，證明PGS/SF有利于VSMCs的黏附與增殖。從圖4和圖5中也可以看出，HUVECs和VSMCs能同時在PGS/SF材料上黏附和增殖，說明HUVECs和VSMCs能同時在材料上進行共培養。

2.3.2 MTT測試

HUVECs和VSMCs在PGS/SF材料上細胞數量隨著培養天數的增加而增加，加載VEGF的PGS/SF材料上HUVECs的細胞數量多于未加載VEGF PGS/SF材料上的細胞數量，說明加載VEGF能促進HUVECs的黏附和增殖。

3 結論

（1）隨著PGS的固化和固化溫度的升高，PGS的熔融溫度和結晶溫度逐漸降低。

（2）PGS/SF小口徑人工血管的疏水性隨著固化溫度的升高而逐漸增強。斷裂強度和斷裂伸長率隨著固化溫度的升高而呈上升趨勢，楊氏模量隨著固化溫度的升高而逐漸降低。

（3）PGS/SF材料有利于HUVECs和VSMCs的黏附和增殖，加載VEGF能促進HUVECs的黏附和增殖，HUVECs和VSMCs能同時在PGS/SF膜上共培養。