結核病疫苗及接種策略研究進展

王元智 梁正敏 屈孟錦 周向梅

卡介苗(BCG)是目前唯一獲準使用的結核病疫苗，自1921年首次應用于人體以來，全球已約有80%的國家將其列入免疫規劃[1]。雖然BCG在預防嬰幼兒結核性腦膜炎和播散性結核病中已表現出明顯的有效性，但是其針對青少年和成人的保護效果在不同的地理區域差異較大，并且對結核分枝桿菌的原發感染以及潛伏感染的激活也缺乏有效保護，因此，開發新型疫苗成為結核病研究的優先領域[2]。當前需要的疫苗應能提供比BCG更好的保護效果，能預防所有類型的結核病(包括耐藥結核病和結核分枝桿菌潛伏感染)，對包括人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)感染者在內的所有年齡段人群都有持續保護作用[2]。經過全球結核病研究工作者的不懈努力，目前已有20多種候選疫苗通過臨床研究取得一定進展，在安全性、免疫原性、輔助治療等方面表現出了一定優勢，但是由于結核病發病機制和宿主免疫反應的復雜性[3]，現有的候選疫苗尚不足以替代BCG。此外，也有研究者試圖通過調整疫苗接種途徑和免疫策略來提高疫苗免疫強度、延長疫苗保護時間，并取得一定進展。筆者就目前國內外進入臨床試驗階段的新型結核病疫苗、多樣化的接種途徑以及免疫策略予以綜述，總結關于提高疫苗保護效果的相關信息，以期為臨床前和臨床試驗方案的并行改進提供參考。

結核病疫苗研究概況

雖然約85%～95%的人群在感染結核分枝桿菌后是可以控制的，未出現任何結核病相關癥狀[4]，但是當前結核病的流行現狀表明，多數人并不能僅依靠自身對結核分枝桿菌感染產生充分的免疫抵抗力，這突出了接種疫苗的重要性。BCG目前是全球應用最廣泛的結核病疫苗，是一種減毒牛分枝桿菌活疫苗。大多數國家通常會在嬰兒出生后數日內或首次接受衛生服務時即接種BCG，目前全球已累計接種超過40億劑[1]。世界衛生組織發布的文件表明，雖然接種BCG可預防兒童結核性腦膜炎和播散性結核病，但不能預防成年人感染結核分枝桿菌[2]，這是導致青少年及成年人患肺結核的重要原因。此外，對免疫功能缺陷患者(如艾滋病患者)接種BCG時，發生播散性結核分枝桿菌感染的風險是正常兒童的數百倍，且預后較差，嚴重者可致死[5]，這使人們不得不對BCG的安全性進行重新評估。鑒于目前結核病的持續流行和耐藥菌株的傳播，亟待研發一種免疫持續期更長且對成年人及免疫功能缺陷人群安全有效的新型結核病疫苗。根據不同用途，目前進入臨床試驗階段的結核病疫苗可大致分為感染預防、疾病預防、復發預防或輔助治療用疫苗；根據研發平臺的不同又可分為兩大類：分枝桿菌全菌衍生疫苗(活疫苗、滅活疫苗)和針對特定抗原的亞單位疫苗。

一、分枝桿菌全菌衍生疫苗

全菌疫苗來源于結核分枝桿菌、BCG或與之密切相關的非結核分枝桿菌。這類疫苗可進一步細分為經基因修飾的減毒活疫苗(VPM 1002、MTBVAC)[6-7]、全菌或其提取物制成的滅活疫苗(Vaccae、MIP、DAR-901、RUTI)[8-11]。分枝桿菌全菌衍生疫苗作為一種引人注目的疫苗，具有幾項特殊優勢。其中最主要的是BCG這種全菌減毒活疫苗的有效性已經在全球得到證實，為全菌衍生疫苗的研發提供了堅實的理論支撐。此外，全菌來源的疫苗包含許多不同的抗原成分，由于脂類、糖脂(廣泛存在于結核分枝桿菌表面)、代謝產物、磷酸化抗原等非蛋白質抗原的存在，因此有可能比亞單位疫苗更能激發多種免疫反應，發揮更加全面的保護作用。

除了考慮疫苗的免疫原性以外，安全性也是候選分枝桿菌活疫苗的一個至關重要的考慮因素。盡管全菌疫苗具有高度的免疫原性，但由于減毒菌株可在體內存活較長時間，因此仍存在引起不良反應的風險，必須對它們的安全性進行廣泛、長期的臨床評估。目前，基因修飾BCG(VPM 1002)已在南非感染HIV的嬰兒中完成了臨床Ⅱa期評估。該試驗是在對健康嬰兒和成人進行廣泛的臨床前評估和安全性及免疫原性論證之后開始的，暫未發現任何安全問題[12]。如果在臨床 Ⅲ 期評估試驗中證明 VPM 1002 在HIV陽性和陰性嬰兒上都比BCG更加安全，那么它可能將是繼BCG之后第一個進入市場的新型結核病疫苗。減毒結核分枝桿菌(MTBVAC)也已在瑞士和南非完成了臨床 Ⅱa 期的評估，發現對成人和兒童都是安全的[13]。熱滅活母牛分枝桿菌(Vaccae)在我國已經被批準為結核病患者的輔助治療用疫苗，可調節外周血T淋巴細胞及細胞因子水平，增強機體免疫功能，促進病灶吸收[14]。而熱滅活非結核分枝桿菌(MIP)在印度被批準為麻風病疫苗，但是作為治療性疫苗，它們的作用機制尚不明確，有待相關試驗結果進行證明。而結核分枝桿菌細胞壁(RUTI)作為一種有潛力的治療用疫苗，在經異煙肼治療1個月后的結核分枝桿菌潛伏感染者中進行評估，發現其對結核分枝桿菌潛伏感染者是安全且具有免疫原性的，目前RUTI正在感染和未感染HIV的結核分枝桿菌潛伏感染人群中進行臨床評估，并計劃對耐多藥結核病患者進行一項附加試驗[15]。以上進入臨床試驗階段的結核病疫苗，雖然分別在安全性、免疫原性、輔助治療等方面表現出了一定優勢，但是尚未足以替代BCG，能否進入市場取決于后續的臨床評估試驗結果。

二、亞單位疫苗

亞單位疫苗多數屬于增強疫苗，作為BCG接種后的增強劑，可改善或延長BCG誘導的免疫反應，具有一定的應用前景。其中以M72/AS01為代表，該候選疫苗的Ⅱb期臨床試驗結果顯示，疫苗可對結核分枝桿菌感染者產生約50%的保護功效(90%CI：12%～71%)；在感染結核分枝桿菌的成人中，接種M72/AS01疫苗可提供至少3年的預防潛伏感染發展為活動性結核病的免疫保護[16]。如果該研究結果在Ⅲ期臨床試驗中得到證實，那么這種亞單位疫苗將非常有利于全球結核病預防工作。亞單位疫苗可進一步細分為添加佐劑的蛋白亞單位疫苗和重組病毒載體疫苗，如表1所示。添加佐劑的亞單位疫苗由單個抗原蛋白或一系列連接的抗原蛋白組成，與佐劑一起使用以增強對免疫系統的刺激，使疫苗中所含抗原的免疫影響最大化；重組病毒載體疫苗類似于添加佐劑的亞單位疫苗，病毒載體的目的是對所提供的抗原激發強烈且持久的免疫應答，從而避免對外源性佐劑的需要。與全菌疫苗相比，亞單位疫苗只針對少量選定的抗原，通常為6種或更少，因此開發亞單位疫苗的一個主要挑戰是需要確定在這些疫苗中包含的最佳抗原，篩選安全有效的結核保護性抗原是研發新型亞單位疫苗的第一步。為此，科學家們進行了大量的篩選工作，從大約4000個結核分枝桿菌基因中確定與表達關鍵抗原相關的基因，這些關鍵抗原可以引起機體的保護性免疫應答[17]。李菲[18]將潛伏期細菌表達的優勢抗原與生長期細菌的優勢抗原結合，篩選免疫原性較強的結核分枝桿菌潛伏期抗原，制備含結核分枝桿菌潛伏期抗原的新型治療性融合蛋白疫苗。目前臨床試驗階段的疫苗中包含的抗原都已在結核病疫苗接種動物模型上進行了試驗，以驗證它們是否具有誘導某種形式的結核病保護性免疫的能力，而篩選標準則是它們應具有誘導Th1類細胞因子[γ- 干擾素(IFN-γ)和腫瘤壞死因子]釋放的能力，制定這種篩選標準的依據是臨床上艾滋病患者具有較高的結核分枝桿菌原發性感染發生率或結核分枝桿菌潛伏感染再激活發生率[19]，然而這些特征是否會導致保護性免疫的產生尚未確定。

結核病疫苗接種途徑

開發持久有效的結核病疫苗的一個主要障礙是誘導和維持肺部的T細胞反應，以便結核分枝桿菌感染后可以立即得到控制，同時誘發系統性記憶細胞庫以補充肺部組織。然而常規的注射途徑(皮內和肌內注射)并不能誘導肺內高頻率的常駐記憶T細胞產生，對于BCG接種劑量和接種途徑影響全身和組織特異性T細胞免疫機制的認識尚且有限，此項研究一直沒有取得突破性進展。直至最近有研究發現在對結核分枝桿菌高度敏感的恒河猴中，靜脈注射BCG可預防或大大限制結核分枝桿菌的感染[20]，從此疫苗接種途徑對臨床疾病防控效果的影響才重新走入我們的視線。雖然結核病疫苗的一些非常規接種途徑具有其獨特的優勢，但是由此造成的安全性和耐受性問題，或將成為制約此項研究進展的重要因素。

表1 進入臨床試驗階段的亞單位疫苗

一、靜脈接種

近期，美國國立衛生研究院過敏與傳染病研究所(NIAID)的研究人員發現，只需將適當劑量的BCG由皮下注射改為靜脈注射就可以大大提高疫苗對恒河猴免受結核分枝桿菌感染的保護效果，與皮內或氣溶膠接種相比，靜脈接種免疫在血液、脾臟、支氣管肺泡灌洗液和肺淋巴結中誘導了更多的效應性CD4+和CD8+T細胞應答。此外，靜脈接種還誘導了遍布在肺實質組織中的高頻率效應性T細胞[20]。靜脈接種BCG在重癥結核病動物模型中提供了前所未有的保護程度，代表著結核病疫苗研究領域的重大進步，這對疫苗接種和臨床開發具有重要意義，并為定義免疫相關因素和疫苗引起的抗結核保護機制提供了一個模型。此外，NIAID還計劃在臨床試驗中對靜脈注射BCG進一步解析，確定這種免疫途徑是否可以改善疫苗保護青少年和成年人免受結核分枝桿菌感染的效果[20]。然而目前沒有哪一種結核病疫苗是允許靜脈注射的，這種注射途徑帶來的安全風險是阻礙其用于臨床的主要原因。

二、氣溶膠接種

目前所有處于臨床 Ⅰ 期以后的結核病疫苗都是通過肌內注射或皮內注射的方式接種的，可能無法在肺中產生足夠多的關鍵免疫細胞，而通過氣溶膠方式接種結核病疫苗或可直接刺激呼吸道黏膜和支氣管周圍對結核分枝桿菌的免疫反應，從而將結核分枝桿菌控制在感染初期。BCG噴霧劑曾在20世紀60年代被首次用于兒童和青少年，并沒有關于出現不良反應的報道[21]。一些臨床 Ⅰ 期的研究也正在探索通過氣溶膠方式接種包括BCG和MVA85A在內的各種疫苗，檢測其安全性和免疫原性，發現氣溶膠接種途徑的耐受性良好，與注射接種途徑相比，氣溶膠接種途徑還可以誘導更強的黏膜免疫和全身性免疫[22]。另外，一些臨床前的研究則通過探討單獨氣溶膠接種或氣溶膠接種與注射接種相結合的免疫效果，試圖找到最佳的免疫組合策略[23]。由于氣溶膠接種途徑是一種使疫苗接種途徑與感染途徑相匹配的免疫方法，這種免疫方式不僅具有將疫苗直接送到呼吸道黏膜的優勢，且操作方便、節約成本，因此在新型結核病疫苗的臨床評價上具有廣闊的應用前景。

三、干粉吸入接種

噴霧干燥法是最近才被應用于制造干粉疫苗的新工藝，該項工藝為可吸入顆粒疫苗的面世提供了可能。這些疫苗干粉具有空氣動力學特性，吸入后可沉積在肺黏膜上，從而發揮更好的免疫保護作用。由于最初的結核分枝桿菌感染發生在肺部深處，其后是相鄰支氣管和肺泡表面形成肉芽腫，干粉噴霧接種途徑接種的結核病疫苗也可直接進入肺部深處，因此具有更好誘導黏膜和系統性免疫反應的優勢。干粉疫苗的適用性此前已被證明可用于流感和狂犬病疫苗的接種[24-25]，但是仍需要在疫苗配方和遞送方面進行大量研究，以確保可吸入結核病疫苗的安全性和有效性優于常規注射疫苗配方。Aneesh等[26]研究表明，噴霧干燥法處理后的結核亞單位疫苗仍保留完整可識別的抗原表位和佐劑活性，可誘導與未干燥處理疫苗類似的抗原特異性Th1、Th17和體液免疫反應，以及多功能CD4+T細胞反應；這些結果為開發一種耐高溫、以干粉為基礎的結核病疫苗提供了理論基礎，使結核病疫苗具有更好的儲存穩定性并減少對冷鏈設施的依賴，從而降低疫苗成本、簡化接種途徑，這有利于針對威脅全球公共衛生安全的傳染性疾病(如結核病)開展大規模免疫運動。

四、口服接種

基于在巴西地區的長期使用以及近期英國的臨床研究，口服BCG(Moreau Rio de Janeiro亞株)被證明是行之有效的，在皮內接種BCG之前口服單劑量的BCG可以在至少3個月之內提高結核菌素皮膚試驗檢測到的IFN-γ水平。值得注意的是，這種特殊的BCG亞株攜帶一個獨特的RD16區域，該區域與其口服時的安全性密切相關[27]。此外，研究人員對BCG丹麥株(BCG-Danish)也進行了口服接種和皮內注射接種對比的小規模試驗，未檢測到不良反應。雖然皮內接種BCG可在血液中誘導更強的免疫反應，但口服BCG誘導了更強的支氣管相關淋巴組織和分泌型IgA相關黏膜免疫反應[28]。口服疫苗作為一種有吸引力的接種途徑，不僅是因為易于給藥，也因為其可以誘導遠端黏膜免疫應答。即使開發口服疫苗具有一定的挑戰性，因為它需要疫苗足夠穩定以承受胃中嚴酷的酸性環境，并且需要一種可以降低耐受性風險的佐劑，但口服結核病疫苗作為一種增強呼吸道和全身黏膜免疫反應的接種途徑，具有其獨特的優勢。

結核病疫苗免疫策略

一、初免-加強免疫策略

除了多樣化的疫苗接種途徑之外，研究人員還在開發同源加強免疫或異源加強免疫的潛在能力。在同源加強免疫策略中，結核病疫苗的初免和加強階段均接種相同種類的疫苗，提供相同的結核病抗原；在異源加強免疫策略中，則通過接種不同種類的疫苗，提供相同的結核病抗原。鑒于以不同方式提供抗原可能會刺激更加廣泛的免疫應答，以及作為克服反向遺傳載體疫苗免疫問題的手段，異源加強免疫策略變得越來越有吸引力。研究表明，在腺病毒-35載體結核病疫苗(表達Ag85A、Ag85B和TB10.4蛋白)的加強免疫下，重組BCG疫苗可誘導恒河猴產生更加強烈的抗原特異性T細胞反應[29]。同時，BCG也可用于DNA疫苗的加強免疫：以載有Ag85B、MPT64和 MPT83 抗原基因的DNA疫苗作為初免疫苗，再以BCG作為加強免疫疫苗。這種異源加強免疫策略可以刺激機體產生更強的免疫反應，與單獨使用BCG相比可以更好地抵抗結核分枝桿菌的感染[30]。此外，精心設計的異源加強免疫策略還可擴大免疫反應的范圍。中國第二軍醫大學的研究人員首先用早期分泌抗原靶6(ESAT-6)的DNA疫苗免疫小鼠，誘導Th1型免疫應答；再用含有相同抗原的重組蛋白疫苗加強免疫，誘導Th2型免疫應答。研究結果表明，當動物受到DNA和亞單位疫苗的聯合刺激后，抗體和Th細胞增殖反應均明顯增強，IFN-γ 的產生明顯增加，IgG2與IgG1之比以及T細胞的細胞毒性也明顯增大[31]，這對通過調整免疫策略預防結核感染具有重要意義。

雖然“卡介苗初免-異源加強免疫策略”的臨床前研究已經進行了很長的時間，但是這種免疫策略仍未充分顯示出優于BCG單獨免疫的保護效果。研究發現，感染結核分枝桿菌前加強BCG免疫可以誘導很強的Th1型免疫反應并產生大量分泌細胞因子的T細胞，然而分泌白細胞介素(IL)-2 的中樞記憶性T細胞(TCM)的量卻沒有增加。相反，感染結核分枝桿菌后加強BCG免疫則可以明顯增加TCM和分泌IFN-γ的效應記憶性T細胞(TEM)，TCM在遇到相同抗原刺激時會分泌大量的IL-2，并快速增殖分化為效應T細胞[32]，小鼠過繼轉移實驗顯示 TCM能夠有效控制結核分枝桿菌的原發感染[33]。另外兩項過繼轉移實驗也表明， TCM比 TEM能夠更加有效地抵抗結核分枝桿菌感染，當前一些進入臨床試驗的結核病疫苗也同樣強調誘導具有長期保護作用的TCM產生的重要性[34]。因此，誘導更加豐富的 TCM的產生，可能是決定“卡介苗初免-異源加強免疫策略”能否抵抗結核分枝桿菌原發感染的重要因素。

二、調整接種時間間隔

BCG能夠有效地控制兒童結核性腦膜炎和播散性結核病的發生，但是它刺激產生的保護性免疫隨著年齡的增加逐漸減弱，對成人肺結核保護效果不確定。研究表明，BCG的持續刺激只能誘導較多壽命短暫的效應記憶性T細胞和效應T細胞的產生，而提供長效免疫保護效果的中樞記憶性T細胞產生較少[35]，這可能是導致BCG刺激產生的保護性免疫隨著年齡的增加逐漸減弱的重要因素。因此，研發新的結核病疫苗和有效的免疫策略來提高中樞記憶性T細胞的數量，增強長期的保護效果，是目前抵抗結核分枝桿菌感染的重要研究方向。根據記憶T細胞發育的原則，每次加強免疫至少應間隔2～3個月的時間，才能誘導產生更多的中樞記憶性T細胞，因此優化結核病疫苗免疫接種間隔對于誘導長效的免疫記憶具有重要意義。有研究發現，采用以融合蛋白ESAT6-Ag85B-MPT64 (190-198)-Mtb8.4-Rv2626c (LT70)為基礎的亞單位疫苗，分別按照“0周-3周-6周”“0周-4周-12周”或“0周-4周-24周”的時間順序免疫小鼠，后兩種免疫策略比第一種免疫策略可誘導產生更高水平的 IL-2、IFN-γ 和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)，其中“0周-4周-12周”的免疫策略誘導產生的中樞記憶性T細胞數量最多，免疫反應最強烈，可以更加有效地抵抗結核分枝桿菌的感染[34]。此項研究結果提示，調整結核病疫苗的接種時間間隔，在一定程度上有助于誘導產生更豐富的中樞記憶性T細胞，增強對結核分枝桿菌感染的免疫保護。

總結與展望

鑒于目前結核病的發病人數、死亡人數以及耐藥菌株的傳播，如何讓未感染人群預防結核病，清除潛伏感染人群的細菌預防發病，治療已經發病的個體，成為當下結核病防治工作的重點。其中保護未感染人群是結核病防控的重要策略之一，因此開發新型結核病疫苗仍然是一項關鍵的全球衛生優先事項，為青少年和成年人接種疫苗也是控制結核分枝桿菌傳播的最有效方式。目前，國內外新型結核病疫苗研究取得了巨大進展，有多個疫苗已進入臨床試驗階段，為疫苗預防結核病的策略和候選疫苗的構建，提供了進一步發展的前景。但是結核病疫苗的發展仍然受平臺、經費、政策等多種因素制約，其首要因素是如何提高臨床開發效率。長期臨床跟蹤研究可以有效地探索結核病疫苗的保護效果和保護作用的持續時間，特別是在不同的環境、人群和年齡段中，以及疫苗接種對結核病發病率和死亡率的影響。多樣化的結核病疫苗類型、接種途徑和免疫策略代表了增加未來疫苗成功概率的新策略，臨床前和臨床試驗方案的并行改進將使我們能夠在更短的時間內以更低的成本收集更多關于提高疫苗效力的信息，從而打破結核病疫苗的發展壁壘。當然，改進結核病疫苗防控效果的研究過程漫長且花費巨大，必須經過全球的共同努力來實現。