蘭州鲇精液超低溫冷凍保存技術研究及細胞損傷檢測

邢露梅 肖 偉, 李蘭蘭 張利平 賽清云, 俞兆曦, 吳旭東 * 連總強 *

(1. 甘肅農業大學動物科學技術學院, 蘭州 730070; 2. 寧夏回族自治區水產研究所(有限公司), 銀川 750001;3. 寧夏漁業工程技術研究中心, 銀川 750001; 4. 寧夏漁業科技院士工作站, 銀川 750001)

蘭州鲇(Silurus lanzhouensisChen)俗稱黃河鯰[1],是黃河中上游特有的重點保護經濟魚類, 具有刺少、肉多和味美的特點, 富含多種人類必需氨基酸,俗有“黃河鯰魚活人參”之美稱, 2014年被評為“黃河生物名片”, 具有重要的生態功能和廣闊的養殖前景[2,3]。近年來由于水利工程建設、生境破壞及過度捕撈等原因, 蘭州鲇野生種群數量逐年下降,被《中國物種紅色名錄》列為瀕危物種[4], 有效保護和科學利用這一重要生態位重點保護經濟魚類種質資源成為黃河生態文明建設的重要內容之一。目前已開展野生馴養和人工繁育等試驗研究及定期增殖放流等保種救護工作[2,3,5], 但傳統活體保種中面臨著可能產生的世代間隔、基因丟失和遺傳漂變等常見問題。

超低溫冷凍保存技術是動植物種質資源保護最直接有效的方法之一[6], 目前魚類遺傳材料保存相關領域的研究主要集中在魚類精子凍存與復蘇等方面[7], 迄今已相繼建立200多種魚類精子冷凍保存技術[8], 斑點叉尾鮰(Ictalurus Punctatus)[9]、藍鯰(Ictalurus furcatus)[10]及黃顙魚(Pelteobagrus fulvidraco)[11]等多種魚類精子超低溫冷凍保存技術已用于實際生產。但由于不同魚類其精子結構、滲透壓、pH及精漿成分等生理特性差異, 很難找到一種通用方法[12], 目前尚未見蘭州鲇精子冷凍保存相關研究報道。為進一步加強蘭州鲇這一瀕危特有經濟魚類種質救護、保種和可持續利用, 本文通過開展蘭州鲇精液超低溫保存抗凍劑與凍存、解凍技術相關研究, 探討冷凍和解凍對精子的損傷機制,以期為蘭州鲇種質資源保護和新品種開發提供一定理論依據和技術支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗用蘭州鲇采自寧夏回族自治區水產研究所國家級黃河鯰原種場, 選擇健康體質健壯且無病無傷的性成熟雄性親魚, 魚用促黃體生成素釋放激素類似物A2(LRH-A2)和地歐酮(DOM)注射(2.5 μg/kg LRH-A2+1.5 mg/kg DOM)催產12—16h后, 用指壓法采集精液, 鏡檢精子活力大于85%以上精液用本實驗室自制保存液C液(檸檬酸鈉三鈉34 mmol/L、葡萄糖146.5 mmol/L、氯化鉀4 mmol/L、碳酸氫鈉23.80 mmol/L、青霉素80萬IU/L和鏈霉素100萬IU/L)稀釋8倍, 置于4℃培養箱冷藏備用。

1.2 抗凍劑篩選

根據預試驗結果, 分別設置二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide, DMSO)及甲醇(Methyl alcohol,MeOH)5%、10%、15%及20% 四個濃度組, 設置N,N-二甲基甲酰胺(N, N-Dimethylformamide, DMF)3%、5%、10%及15% 四個濃度組, 每組設置3個重復。吸取1 mL的精液保存液(稀釋精液添加抗凍劑)至細胞凍存管, 4℃平衡30min, –80℃平衡30min后迅速投入液氮中冷凍保存。24h后從液氮中快速取出凍存管, 置于37℃水浴搖晃解凍至冰晶剛融化, 立即吸取2.5 μL精液加10 μL去離子水(曝氣24h)混合進行精子激活, 置于光學顯微鏡下測定精子激活率(激活后運動精子數量占全部精子數量的百分比), 每個樣本重復檢測3次。

1.3 程序凍存與解凍處理條件篩選

以1.2中篩選獲得的最佳抗凍劑及最佳濃度配制精液凍存液, 依次分別開展凍存中4℃平衡時間、–80℃平衡時間和解凍溫度篩選等3個單因素分析試驗。其中: 4℃平衡時間篩選設置0、10、20、30和40min五個處理組(n=3), 其他方法同1.2;固定篩選獲得的最優4℃平衡時間條件, 設置0、15、30、45和60min5個處理組(n=3)進行–80℃平衡時間條件篩選, 其他方法同1.2; 固定篩選獲得的最優4℃和–80℃平衡時間條件, 設置27℃、32℃、37℃、40℃、42℃5個處理組(n=3)進行適宜解凍溫度篩選, 其他方法同1.2。

1.4 凍存損傷檢測

以鮮精為對照, 采用3種方法進行最佳程序凍存與解凍條件處理后精子凍存損傷檢測。對鄧爽等[13]單細胞凝膠電泳(Single-cell gel electrophoresis,SCGE)方法改進后進行核DNA損傷檢測(n=100),Nikon TE2000熒光顯微鏡于綠光激發光下觀察并拍攝彗星圖片。采用掃描電鏡(Scanning electron microscope, SEM)法和透射電鏡(Transmission electron microscopy, TEM)法[14]觀察凍精超微結構損傷。

1.5 統計學處理

彗星圖像用CASP軟件分析獲得尾部DNA含量百分比(DNA in Tail)、Olive尾距 (Olive tail moment, OTM)等比例參數評估精子DNA損傷(Sperm DNA fragmentation, SDF)。將蘭州鲇精子核DNA損傷程度按照彗星尾部DNA含量百分比分為5級:G0級為＜5%, G1級為5%—20%, G2級為20%—40%,G3級為40%—95%, G4級為＞95%, 彗星率=(彗星細胞數目/總細胞數目)×100; 損傷系數=[(G0級損傷的細胞個數×0)+(G1級損傷的細胞個數×1)+(G2級損傷的細胞個數×2)+(G3級損傷的細胞個數×3)+(G4級損傷的細胞個數×4)]。

試驗數據分析采用Excel整理, 通過SPSS21.0軟件單因素方差分析(One-way ANOVA)檢驗各組精子活力的差異顯著性, 統計結果以Mean±SD表示。

2 結果

2.1 抗凍劑種類與濃度對精子冷凍保存效果的影響

不同抗凍劑對蘭州鲇精液冷凍保存試驗表明(圖 1), 各組激活率與鮮精差異顯著(P≤0.05), 且3種抗凍劑對精子保護效果隨濃度增加呈先升后降的趨勢。DMF抗凍劑組中5% DMF凍精激活率(37.78±7.54)%顯著高于其他3個濃度(P≤0.05)。15% MeOH組凍精激活率為(36.67±3.53)%, 顯著高于MeOH抗凍劑組其他3個濃度組(P≤0.05)。DMSO抗凍劑組中10% DMSO對蘭州鲇精子保護效果最好, 激活率達(52.78±7.54)%, 顯著高于其他各組(P≤0.05)。5% DMF、5% DMSO、15% DMSO及15% MeoH組激活率相比無顯著差異(P＞0.05), 但顯著低于10% DMSO組(P≤0.05)。

2.2 4℃平衡時間對精子冷凍保存效果的影響

4℃平衡時間對蘭州鲇精子冷凍保存效果影響(圖 2A), 平衡時間20min時激活率最高, 達(69.44±8.45)%, 平衡10min與30min凍精激活率差異不顯著(P＞0.05), 但顯著低于20min組(P≤0.05), 平衡時間40min凍精激活率顯著低于10 min和30 min, 不平衡組凍精激活率最低, 為(11.11±4.86)%, 各組凍精激活率與鮮精相比均差異顯著(P≤0.05)。

2.3 –80℃平衡時間對精子冷凍保存效果的影響

蘭州鲇精子?80℃平衡時間為30min時激活率最高(圖 2B), 達(71.66±7.52)%, 其次是15min, 激活率為(54.16±8.61)%, 兩者之間差異顯著(P≤0.05),平衡時間45min與60min激活率差異不顯著(P＞0.05), 但顯著低于15min、30min組(P≤0.05), 未平衡組僅可見個別精子被激活, 凍精激活率為(0.33±0.52)%, 各組凍精激活率與鮮精相比差異均顯著(P≤0.05)。

圖 1 不同抗凍劑不同濃度對蘭州鲇精子超低溫冷凍保存效果的影響Fig. 1 Effects of different antifreeze agents on cryopreservation of spermatozoon in S. lanzhouensis

2.4 解凍溫度對精子冷凍保存效果的影響

解凍溫度對蘭州鲇精子冷凍保存影響(圖 2C),隨解凍溫度升高精子激活率呈先升后降趨勢, 40℃組凍精激活率(75.56±3.91)%最大, 顯著高于27℃、32℃和37℃組(P≤0.05), 與42℃組凍精激活率(68.89±3.33)%差異不顯著(P＞0.05); 32℃、37℃和42℃組凍精激活率差異不顯著(P＞0.05), 27℃組凍精激活率顯著低于其他組(P≤0.05), 各組凍精激活率與鮮精相比差異均顯著(P≤0.05)。

2.5 蘭州鲇鮮精及凍精核DNA損傷SCGE檢測

如圖 2D所示, 10月份采集鮮精激活率相較于7月份顯著降低(P≤0.05), 與7月份凍精激活率相當(P＞0.05); 10月份凍精與7月份凍精差異顯著(P≤0.05)。10月份采集蘭州鲇精液用最優組凍存方法凍存1個月, 鮮精及凍存10d、20d、30d凍精進行SCGE檢測, 將精子分為5級: G0級精子正常的非彗星樣細胞, 精子核完整(圖 3A); G1級精子核縮小可見慧尾, 輕度損傷(圖 3B); G2級精子核進一步縮小,彗尾明顯延長, 中度損傷(圖 3C); G3級精子屬于重度損傷, 精子核明顯縮小, 彗尾較長(圖 3D), 未見G4級完全損傷精子, 計算各級別精子占精子總數百分比, 同時統計彗星率和損傷系數。結果如表 1所示, 凍精與鮮精相比G0級精子差異顯著(P≤0.05),G1、G2和G3級精子增多但無顯著差異, 10d、20d和30d凍精各級精子差異均不顯著(P＞0.05), 鮮精彗星率、損傷系數與凍精有顯著差異(P≤0.05),但各凍存組之間差異不顯著(P＞0.05)。

2.6 蘭州鲇精子凍存形態與超微結構損傷分析

應用掃描電鏡檢測法進行蘭州鲇精子凍存形態結構損傷分析, 結果表明: 鮮精中27%精子形態結構異常, 凍精中47.4%精子形態結構異常。蘭州鲇正常精子結構屬于鞭毛型, 由頭部、中段和尾部組成, 無側鰭, 頭部圓球形, 直徑約(1.57±0.08) μm, 中段明顯, 呈袖套狀, 長徑約(1.23±0.12) μm, 短經約(0.52±0.12) μm, 尾部鞭毛細長約(41.92±3.39) μm, 核膜與質膜平滑完整(圖 4A)。凍存對蘭州鲇精子形態結構的損傷主要表現為: 凍存損傷精子整體未發生膨脹, 但存在頭部細胞膜出現破損(圖 4B和4C)、皺縮凹陷變形(圖 4D)、中段袖套結構破裂、線粒體脫落(圖 4B)和尾部鞭毛發生斷裂(圖 4B)的情況。

應用透射電鏡檢測法進一步分析凍存對蘭州鲇精子超微結構損傷情況, 結果表明: 正常蘭州鲇精子頭部主要由細胞核構成, 外部可見清晰質膜包裹, 前端無頂體或類似頂體膜結構。細胞核與質膜之間空隙含有極少細胞質, 無其他細胞器(圖 5A和5B)。核內染色質致密, 核空泡位置、形狀和大小不定, 頭部后端有一植入窩, 含有由近端中心粒和基體(又稱遠端中心粒)兩部分組成中心粒復合體,近端中心粒緊貼核膜, 近端與遠端中心粒處于同一直線, 且其長軸相互垂直, 呈“T”形(圖 5A)。中段袖套結構緊連頭部尾端, 圍繞尾端軸絲近似對稱分布,富含線粒體, 線粒體及其他細胞器分層排列(圖 5C)。袖套與軸絲之間空腔為袖套腔。尾部(鞭毛)發生于基體, 尾部的橫切面呈卵圓形(圖 5D), 直徑0.26—0.30 μm, 由軸絲及附屬纖維構成, 軸絲由9組外周纖維和2條中央纖維組典型的“9+2”微管結構, 無側鰭(圖 5D)。凍存后部分精子超微結構發生了不同程度的損傷, 主要表現為膜損傷, 細胞質與染色質膜發生破損、折皺、囊泡化或整體脫落(圖 5E和5F), 細胞核與質膜空隙加大, 核質疏散(圖 5E和5G), 線粒體結構彌散, 線粒體內容物外流(圖 5E和5G), 中心粒復合體發生易位(圖 5E), 鞭毛外膜變形脫離, 發生斷裂(圖 5H), 微管結構基本完好(圖 5I)。

圖 2 不同平衡時間、解凍溫度及采集時間對蘭州鲇精液激活率的影響Fig. 2 Effects of different equilibrium time defrost temperature and collection time on semen activation rate of S. lanzhouensis

圖 3 精子單細胞凝膠電泳(SCGE)圖Fig. 3 Comet image of spermatozoon

3 討論

3.1 抗凍劑種類及濃度對精子活力的影響

隨著水產業快速發展以及種質資源保存、雜交育種和新品種選育等工作的開展, 魚類精液超低溫保存技術研發與應用越來越廣泛。超低溫保存中通過添加適宜抗凍劑可降低細胞內電解質濃度,減少冰晶損傷, 從而大大提高了保存效果, 延長了保存時間。但魚類精子具有種屬特異性, 同種抗凍劑對于不同魚類精子滲透性和毒性不同, DMSO、DMF及MeOH是3種淡水魚類精子冷凍保存常見的滲透性凍存劑。DMSO具有高滲透性, 易和精子膜上磷脂層相互作用, 是目前使用最多的魚類精子冷凍保存抗凍劑之一, 同時DMSO滲入致使細胞內外滲透壓相差太大, 精子細胞可能發生潰解[15], 產生毒性。在鯔(Mugil cephalusLinnaeus)[16]、虹鱒(Oncorhynchus mykissWalbaum)[17]、中國花鱸(LateolabraxjaponicusMcClelland)[18]及Nandus nandus(Hamilton, 1822)[19]等多種魚類精子冷凍保存中,DMSO濃度為8%—12%時對凍精保護作用最好, 且對精子毒性存在劑量依賴性。本研究DMSO對蘭州鲇凍精保護效果高于DMF和MeOH, 10% DMSO效果最好, 且隨著濃度增加凍精激活率遞減, 這一結果與前述研究結論一致。相對而言DMF和MeOH對蘭州鲇凍精保護效果不及DMSO, 與姜仁良等[20]研究發現13% DMF超低溫凍存團頭魴、鯉、草魚及鰱精液受精率高于13%DMSO的結果相悖, 亦與劉光霞等[8]發現圓口銅魚(Coreius guichenotiSauyage et Dabry)精子超低溫凍存研究中10% MeOH凍精活力高于DMF和DMSO的研究結果相悖, 可能原因是精子自身適應能力不同和對抗凍劑滲透性不同, 造成DMF和MeOH不適于蘭州鲇精液保存。

表 1 蘭州鲇凍精SCGE檢測的DNA損傷分級Tab. 1 DNA damage of frozen semen of S. lanzhouensis by SCGE

圖 4 蘭州鲇精子凍存損傷掃描電鏡觀察Fig. 4 The ultrastructure of fresh and cryopreserved spermatozoon atozoa of S. lanzhouensis by SEM

3.2 冷凍程序對精子活力的影響

4℃平衡一段時間有利于精子超低溫凍存時凍存劑充分滲透進精子細胞降低冰晶損傷, 但隨平衡時間增長抗凍劑對精子細胞毒性作用也會增強, 適宜的平衡時間有利于抗凍劑對精子起到良好保護作用。同類抗凍劑對不同魚類精子滲透性不同, 不同魚類4℃平衡時間也不同。黃顙魚[11]、北梭子魚(Esox lucius)[21]及匙吻鱘(Polyodon spathula)[22]等魚類4℃平衡10—15min對精子有良好保護效果, 圓口銅魚[8]4℃平衡25min后冷凍保存效果較好, 而光唇魚(Acrossocheilus fasciatus)[23]精子4℃下平衡30min有較好的冷凍保存效果。本研究中4℃處理20min為蘭州鲇精子適宜的冷凍保存前平衡時間。

超低溫冷凍保存過程中降溫速率太快, 精子細胞中水分來不及滲出易形成冰晶, 損傷精子細胞器及細胞膜, 造成精子運動速率下降及死亡。于–80℃平衡過渡可降低精子因直接放入–196℃液氮形成冰晶造成精子損傷及死亡。Nahiduzzaman等[24]將藍黑鯪(Labeo calbasuHamilton)精子以程序降溫法從5℃降到–80℃超低溫保存, 凍精激活率為75%。丁淑艷等[25]將興國紅鯉(Cyprinus carpio var singuonensis)精子于–80℃平衡15min后保存至液氮中, 解凍后精子活力達83%。本研究中蘭州鲇精液于–80℃平衡30min, 冷凍效果效果最好, 直接投入液氮凍精幾乎全部死亡, 這一結果與前述結論相符。

解凍是冷凍的逆過程, 損傷機制與冷凍損傷類似, 解凍過程滲透壓變化造成精子細胞器損傷, 進而影響精子成活率[8]。不同魚類凍精的解凍溫度因冷凍工藝不同而異, 精子冷凍保存速率越快, 解凍溫度越高, 常用的解凍溫度是30—40℃水浴解凍,適宜的解凍溫度可以使精子度過損傷敏感區[23]。在本研究中, 40℃水浴解凍蘭州鲇精子活力較佳,溫度過高過低都會影響精子活力, Muthmainnah等[26]在39—40℃水浴解凍縱帶紋唇魚(Osteochilus vit-tatusValenciennes)凍精, 史應學等[18]在40℃水浴中解凍中國花鱸凍精, 37℃水浴解凍斑鱖(Siniperca scherzeriSteindachner)精子獲得了較高精子成活率[12]。

圖 5 蘭州鲇鮮精及凍精透射電鏡觀察Fig. 5 The ultrastructure of fresh and cryopreserved spermatozoon atozoa of S. lanzhouensis by TEM

3.3 凍精與鮮精核損傷檢測

精子DNA損傷情況是檢測精子質量的一個重要依據。Miskolczi等[27]研究證明冷凍損傷精子基因組在受精過程中不參與胚胎發育, 致使非洲鲇形成單倍體個體。單細胞凝膠電泳是一種檢測細胞DNA損傷的經典方法, 具有靈敏度高、簡便、經濟和快速等各種優點。細胞通過裂解和DNA解鏈等過程, 經電泳使損傷的DNA從細胞核中溢出, 向陽極泳動, 形成尾狀帶, 即彗尾, 未損傷的DNA部分保持球形, 兩者共同形成“彗星”[28,29]。在本實驗過程中按照徐西長等[30]的方法進行多次單細胞凝膠電泳, 最后都未跑出彗星圖, 而按照鄧爽等方法得到清晰彗星圖像, 可用于蘭州鲇精子DNA損傷檢測。

SCGE檢測的蘭州鲇精子于10月9日采集, 此時已錯過繁殖期, 鮮精活力只有79%, 顯著低于7月份96%, 且精子超低溫凍存損傷程度明顯高于7月份精子。該研究結果與Pérez-Cerezales等[31]研究虹鱒不同季節精子DNA碎片率發現的精子冷凍前差異更容易受到低溫損傷結果一致。因此凍精DNA損傷可能由冷凍工藝和精子冷凍前差異兩個原因造成, 所測得彗星率與損傷系數會較7月份凍精高。一般認為, 精子在液氮(–196℃)中處于休眠狀態, 保存時間長短對精子質量無顯著影響。史應學等[32]發現, 中國花鱸精子超低溫凍存30d后活力無顯著差異, 陳松林等[33]用塑料管法長期保存(1年)與短期保存的鯉、草魚和鰱凍精激活率均在70%左右。周磊等[12]將斑鱖精子液氮保存2—30d的激活率、雜交受精率和孵化率均無顯著差異。本實驗蘭州鲇精子超低溫凍存10—30d激活率、DNA損傷彗星率和損傷系數無顯著差異, 結合相關研究推測精液在液氮中保存時間的長短對凍精影響不大, 但仍需在后續研究中進一步驗證。

3.4 鮮精及凍精超微結構

硬骨魚類精子主要由頭部, 中段和尾部組成,細胞核為頭部主要結構, 中段由中心粒復合體和袖套構成, 尾部鞭毛是其主要運動器官。多種魚類研究表明, 普通形態學與精子超微結構結合運用于魚類系統發育分析為物種分類提供依據, 同一科或亞科的魚類精子結構分布模式有很高的相似性, 存在系統發生的聯系[34,35]。掃描電鏡和透射電鏡觀察發現蘭州鲇精子可明顯分為頭部、中段和尾部, 與索氏六須鲇(Silurus soldatovi)[36]和南方鲇(SilurusmeridionalisChen)[37]等鲇科魚類相同。蘭州鲇球形或橢圓形的精子頭部形態與索氏六須鲇[36]、南方鲇[37]和鲇(Silurus asotus)[38]相似, 主要由細胞核構成, 核質致密。頭部后端有一植入窩含有中心粒復合體, 中心粒軸絲相互垂直呈“T”形, 遠端中心粒向外延伸出尾部軸絲。中段由袖套及中心粒復合體組成, 接連細胞核后端。尾部與南方鲇[37]、鲇[38]和埃及尼羅河鲇[39]等大多數鲇形目魚類一樣, 具單鞭毛和無側鰭, 不同于棘甲鯰科的韋氏上棘鮠和鈍囊鯰屬魚類的雙鞭毛[40]及黃顙精子單鞭毛的兩排側鰭[41]。本研究通過超微形態結構分析, 發現超低溫凍存解凍主要造成蘭州鲇精子膜、線粒體和鞭毛損傷, 同大多數硬骨魚類精子超低溫凍存損傷一樣主要為機械損傷。張雪雷等[42]研究發現大菱鲆超低溫凍存損傷中60%—70%精子為膜損傷, 而膜損傷主要包括結構損傷和化學損傷[43]。結構損傷主要由于降溫過程中細胞內水分未完全脫出形成冰晶,損傷膜蛋白及脂類?；瘜W損傷則主要因冷凍過程中細胞外物質先結冰、細胞內發生脫水、pH與離子濃度等細胞內環境變化及大分子復合物解體, 造成膜結構破損、折皺、囊泡化或整體脫落等不可逆損傷[42,44]。本研究中蘭州鲇凍精發生的細胞質膜和染色質膜破損、折皺、囊泡化或整體脫落, 細胞核與質膜空隙加大等超微結構變化證實了這一觀點。鞭毛是精子運動胞器, 袖套內線粒體則為精子運動的供能場所。中國大鯢(Andrias davidianus)[45]凍精超微結構觀察發現線粒體嵴變形、軸絲彎曲和質膜膨脹等直接導致凍精活力和復蘇率下降。本研究中凍精線粒體結構損傷、中心粒復合體易位和鞭毛外膜變形脫離同樣也嚴重影響鞭毛運動性能, 引起精子活力和受精率下降。本研究中鞭毛微管結構未發生損傷, 但鞭毛與中段連接處發生斷裂, 這是因為鞭毛與中段2種不同的胞骨架連接處結構脆弱, 造成脫節, 與西伯利亞鱘(Acipenser b.baerii)[43]損傷結果一致。