飼料不同水平淀粉對全養殖周期異育銀鯽“中科3號”生長和糖代謝的影響

梅玲玉 韓 冬 巫麗云 郭 偉 劉昊昆 金俊琰楊云霞 朱曉鳴 解綬啟

(1. 中國科學院水生生物研究所淡水生態與生物技術國家重點實驗室, 武漢 430072; 2. 中國科學院大學, 北京 100049;3. 湖北省水產動物營養與飼料工程技術研究中心, 武漢 430072)

碳水化合物作為供能物質, 有提高魚類對飼料蛋白利用率和節約養殖成本的作用。魚類攝食過高碳水化合物水平的飼料會致使魚體生長緩慢、糖代謝紊亂甚至引發代謝疾病[1—3]。魚類與小鼠糖代謝模式相似, 代謝速度相對緩慢[4]。魚體糖代謝調節主要包括激素調節與酶調節。研究表明, 魚類體溫相對較低, 代謝能力較差, 但魚類胰島素分泌量與人類差別不大, 暗示魚類存在非胰島素依賴血糖調節途徑[4—8]。伴隨魚類生長發育過程其消化器官功能不斷完善, 腸道菌群數量、組成和分布不斷變化, 對營養物質的需求也不斷變化, 多種魚類被報道其生長發育過程中食性發生改變[9,10]。

已有研究表明, 魚體規格對糖利用能力有一定的影響。異育銀鯽(Carassius auratus gibelio)幼魚攝食24%—32%淀粉水平的飼料時生長性能及飼料利用較好, 對飼料碳水化合物的最適需求量在30%左右[11—13], 而中規格(52 g左右)和大規格(129 g左右)異育銀鯽的最適飼料淀粉水平分別為29.2%和27.2%[11]。草魚(Ctenopharyngodon idella)幼魚(6.5 g左右)可以較好地利用33%—38%淀粉水平的飼料, 37%淀粉水平的飼料則顯著限制了大規格草魚(398 g左右)的生長[14,15], 青魚(Mylopharyngodon piceus)幼魚(3.5 g左右)攝食含20%淀粉飼料時獲得最大特定生長率和飼料效率[11], 青魚魚種(48 g左右)對飼料糊精的適宜需求量為20%左右[16]。綜上所述, 魚體在不同生長階段對飼料碳水化合物的需求有所差異, 可能與魚體生命周期不同階段生長速度的不同及新陳代謝能力的變化密切相關[17,18]。根據魚體不同生長階段對碳水化合物需求的不同來配制不同的飼料不僅可以促進魚類生長, 還可以節約飼料蛋白質, 降低養殖成本, 減少氨氮排放。而目前關于不同規格魚體對營養元素需求差異的比較研究主要集中于蛋白質, 尚且缺乏較為系統的不同規格魚類對飼料淀粉需求差異的比較研究。因而本實驗以中國較為廣泛養殖的經濟魚類異育銀鯽“中科3號”為養殖對象, 設計淀粉水平為3%、13%、23%、33%和43%五個梯度的飼料, 進行周期為340d的養殖實驗, 比較探究異育銀鯽全養殖周期不同階段對飼料淀粉的需求及糖代謝差異。

1 材料與方法

1.1 實驗飼料

以秘魯魚粉和酪蛋白為主要蛋白源, 以魚油和豆油(1∶1)為主要脂肪源, 以玉米淀粉為主要碳水化合物源, 分別設計淀粉水平為3%(S3)、13%(S13)、23%(S23)、33%(S33)和43%(S43)五個處理組飼料, 將飼料原料粉碎后均勻混合, 魚油豆油1∶1均勻混合后再與原料混勻過40目篩, 飼料制粒后70℃烘干至水分為(10±1)%, 冷卻后儲存于4℃冷庫備用(表 1)。

1.2 養殖實驗設計

本實驗于2016年8月18日至2017年7月20日在湖北省石首市老河漁場長江故道江段網箱進行, 為期340d。

整個實驗分為5個養殖階段: 幼魚期(第63天取樣, D63)、養成前期(第110天取樣, D110)、越冬期(第223天取樣, D223)、越冬后(第275天取樣,D275)和養成中后期(第340天取樣, D340)。除去越冬期D223組外, 每個養殖階段實驗魚投喂5種實驗飼料(表 1), 每個飼料組4個平行, 共計20個網箱。

表 1 飼料配方及化學組成(%干物質)Tab. 1 Formulation and chemical composition of the experimental diets (% dry matter)

實驗魚首先在江段網箱實驗系統中暫養2周,暫養飼料為5種實驗飼料的等量混合飼料。實驗開始前將實驗魚饑餓24h, 隨機選取體格勻稱、健康活潑的實驗魚60尾[初始體重(12.0±0.1) g]放入每個網箱中, 另取15尾實驗魚作為初始樣品, 研究對象為異育銀鯽“中科3號”。實驗期間每天飽食投喂3次(8:00、13:00和18:00), 越冬期間停止投喂實驗飼料。整個實驗均在自然光照周期及溫度條件下進行, D63階段水溫為21.5—30.5℃, D110階段水溫為17.0—21.5℃, 越冬期水溫為3.8—17.3℃, D275階段水溫為17.3—23.5℃, D340階段水溫為18.3—25.8℃。養殖期間溶氧為5.01—6.88 mg/L, 氨氮含量為0.04—0.43 mg/L。

每次樣品采集前, 所有實驗對象饑餓24h, 用MS-222(100 mg/L)將魚麻醉, 對所有網箱的魚分別計數稱重, 隨機挑選規格中等魚體6條稱量體長、體重和體寬, 實驗魚靜脈取血后, 其中2條裝袋作為末樣; 其余解剖分離肝臟、肌肉和腸道組織, 置于–80℃冰箱保存。

1.3 樣品分析

魚體末樣用高壓滅菌鍋 (120℃, 101.33 kPa)處理20min, 冷卻后搗碎, 75℃烘干至恒重后粉碎。干物質測定使用失重法于105℃烘箱烘干至恒重測定,粗蛋白使用凱氏定氮儀(FOSS Teacator, Haganas,Sweden)測定, 粗脂肪使用索氏抽提儀(Soxtec System HT6 Tecator, Haganas, Sweden)測定。灰分使用馬弗爐(湖北英山縣建力電爐制造廠, 湖北英山)于550℃焚燒至恒重進行測定。

尾靜脈抽取血液至1.5 mL離心管(注射器和離心管均用0.2%肝素鈉浸潤), 以3500×g離心5min, 吸取透明上清制備血漿, 血漿葡萄糖和血漿膽固醇含量用全自動生化分析儀(邁瑞BS-460, 中國深圳)及其標準試劑盒(氧化酶法)測定, 具體方法參見儀器使用說明。后腸淀粉酶測定使用南京建成生物工程研究所的試劑盒: 于660 nm波長下測定吸光度值。糖原測定使用南京建成生物工程研究所的試劑盒: 620 nm波長測定吸光度值, 具體方法參見試劑盒說明。

基因表達量的測定用Trizol (Invitrogen, USA)按其說明書步驟提取組織RNA, 1.2%瓊脂糖凝膠電泳測定其完整度, NanoDrop-2000光譜儀測定mRNA純度及濃度后用Invitrogen公司M-MLV Frist-Stand Synthesis System按其說明書反轉錄為cDNA。RTqRCR反應體系為6 μL(3 μL Light Cycle?480 SYBR?GreenⅠ Master、0.24 μL Primer forward、0.24 μL Primer reverse和2.52 μL cDNA)。PCR反應在羅氏Light Cycle 480 Ⅱ(Roche, Basel, Switzerlad)PCR儀上進行。反應程序: 95℃預熱5min, 三步擴增(95℃變性10s, 60℃退火30s, 72℃延伸30s), 45個循環。引物序列見表 2。

表 2 RT-qPCR所用引物Tab. 2 Primers used in RT-qPCR

1.4 統計分析

所有數據采用SPSS 23.0經正態檢驗及方差齊性檢驗后, 進行單因素方差分析(One-way ANOVA),顯著性水平設為P＜0.05, 差異顯著時對各處理組進行Duncan’s多重比較。

2 結果

2.1 飼料淀粉對全養殖周期異育銀鯽魚“中科3號”生長性能和魚體成分的影響

在幼魚期(2016年8月18日至2016年10月17日,第1至第63天, D63), 飼料淀粉水平高于23%處理組的異育銀鯽增重率、特定生長率及肥滿度顯著高于S13與S23組(P＜0.05), 飼料效率隨飼料淀粉水平上升總體呈上升趨勢。其中S23組生長表現最好,各處理組魚體蛋白含量無顯著差異, 魚體脂肪含量隨飼料淀粉水平升高呈先上升后穩定的趨勢, S23處理組魚體脂肪含量最高。在養成前期(2016年10月18日至2016年12月03日, 第64至第110天,D110), 不同處理組異育銀鯽增重率、攝食率、飼料效率、特定生長率及肥滿度隨飼料淀粉水平的升高呈現先上升后下降的趨勢, S13處理組異育銀鯽增重率及特定生長率顯著高于其他各組, 各處理組的魚體粗蛋白含量無顯著差異, 粗脂肪隨飼料淀粉水平的升高呈先上升后下降的趨勢, S13處理組魚體粗脂肪含量最高, 顯著高于其他各組(P＜0.05)。在越冬期(2016年12月04日至2017年3月23日, 第114至第223天, D223), 不同處理組異育銀鯽增重率、特定生長率及肥滿度隨飼料淀粉水平升高呈現先上升后下降的趨勢, 其中S13處理組異育銀鯽增重率及肥滿度顯著高于其他各組(P＜0.05), S3和S13處理組特定生長率顯著高于S23、S33和S43處理組(P＜0.05), 各處理異育銀鯽魚體粗蛋白和粗脂肪均無顯著差異。在越冬后(2017年3月24日至2017年5月14日, 第224至第275天, D275), 各處理組異育銀鯽增重率和特定生長率隨飼料淀粉水平升高呈現上升趨勢, S23、S33和S43處理組增重率顯著高于S3及S13處理組(P＜0.05), 各處理組飼料效率無顯著差異。各處理組異育銀鯽魚體蛋白及魚體脂肪無顯著性差異。在養成中后期(2017年5月15日至2017年7月20日, 第276至第340天,D340), 異育銀鯽增重率及特定生長率隨飼料碳水化合物水平的升高呈先上升后下降的趨勢且S33處理組顯著高于其他各處理組(P＜0.05), 各處理組飼料效率無顯著差異。異育銀鯽各處理組魚體粗脂肪含量無顯著差異, 魚體蛋白含量隨飼料淀粉水平的升高呈先上升后下降趨勢, S33處理組最高(表 3和表 4)。

2.2 飼料淀粉對全養殖周期異育銀鯽魚“中科3號”后腸淀粉酶活性的影響

在幼魚期(2016年8月18日至2016年10月17日,第1至第63天, D63), 各處理組異育銀鯽后腸淀粉酶活性無顯著差異。在養成前期(2016年10月18日至2016年12月03日, 第64至第110天, D110), S3、S13和S23處理組異育銀鯽后腸淀粉酶活性無顯著差異, S43處理組后腸淀粉酶活性顯著高于S33處理組(P＜0.05)。在越冬期(2016年12月04日至2017年3月23日, 第114至第223天, D223), 不同處理組異育銀鯽后腸淀粉酶活性隨飼料淀粉水平升高呈現先上升后下降的趨勢, S23處理組后腸淀粉酶活性最高。在越冬后(2017年3月24日至2017年5月14日,第224至第275天, D275), 異育銀鯽后腸淀粉酶活性隨飼料淀粉水平的升高呈下降趨勢, 在養成中后期(2017年5月15日至2017年7月20日, 第276至第340天, D340), 異育銀鯽后腸淀粉酶活性隨飼料淀粉水平的升高呈現先下降后上升的趨勢。魚體后腸淀粉酶活性在實驗養成前期后高于幼魚期(圖 1)。

表 3 飼料淀粉水平對異育銀鯽“中科3號”生長性能的影響Tab. 3 Effects of dietary starch on growth performance of gibel carp

表 4 飼料淀粉水平對異育銀鯽魚體基本組分的影響(% 濕重)Tab. 4 Effects of dietary starch on body composition of gibel carp(% wet weight)

2.3 飼料淀粉對全養殖周期異育銀鯽魚“中科3號”血漿葡萄糖和血漿膽固醇的影響

在幼魚期(2016年8月18日至2016年10月17日,第1至第63天, D63), 魚體血漿葡萄糖濃度隨飼料淀粉水平升高呈先上升后不變的趨勢, 飼料碳水化合物水平高于23%處理組的異育銀鯽血漿葡萄糖濃度顯著高于飼料淀粉水平低于23%處理組(P＜0.05),異育銀鯽血漿膽固醇濃度無顯著差異。在養成前期(2016年10月18日至2016年12月03日, 第64至第110天, D110), 各處理組異育銀鯽血漿葡萄糖及血漿膽固醇含量無顯著差異。在越冬后(2017年3月24日至2017年5月14日, 第224至第275天, D275), 異育銀鯽血漿葡萄糖濃度隨淀粉水平的升高呈先上升后下降趨勢, S23處理組異育銀鯽血漿葡萄糖濃度最高, 各處理組血漿膽固醇濃度無顯著差異。在養成中后期(2017年5月15日至2017年7月20日, 第276至第340天, D340), 各處理組異育銀鯽血漿葡萄糖濃度無顯著差異, 血漿膽固醇濃度隨飼料淀粉的升高呈現先上升后下降的趨勢, S23處理組血漿膽固醇濃度最高(圖 2)。

2.4 飼料淀粉對全養殖周期異育銀鯽魚“中科3號”肝/肌糖原的影響

在越冬后(2017年3月24日至2017年5月14日,第224至第275天, D275), 各處理組肝糖原無顯著差異, S43處理組肌糖原含量最高, 顯著高于S33處理組(P＜0.05)。在養成中后期(2017年5月15日至2017年7月20日, 第276至第340天, D340), 各處理組異育銀鯽肝和肌糖原含量無顯著差異(圖 3)。

2.5 飼料淀粉對全養殖周期異育銀鯽魚“中科3號”糖代謝基因表達的影響

在實驗幼魚期(2016年8月18日至2016年10月17日, 第1至第63天, D63), 異育銀鯽肝臟glut2、hk和pepckmRNA的相對表達量隨飼料淀粉水平增加呈現上升趨勢,g6pcmRNA相對表達量隨飼料淀粉水平上升呈下降趨勢, 但各處理組間無顯著性差異。S43處理組異育銀鯽gkmRNA相對表達量顯著高于S3和S23處理組(P＜0.05)。在越冬后(2017年3月24日至2017年5月14日, 第224至第275天,D275), 各處理組異育銀鯽hk和g6pcmRNA相對表達量無顯著差異,glut2、gk和pepckmRNA相對表達量隨飼料淀粉水平的升高呈上升趨勢, S43處理組顯著高于其他各組(P＜0.05)。在養成中后期(2017年5月15日至2017年7月20日, 第276至第340天, D340), 異育銀glut2、hk及gkmRNA相對表達量隨飼料淀粉水平的升高呈現上升趨勢, S43處理組相對表達量水平顯著高于其他各處理組(P＜0.05),各處理組異育銀鯽pepck相對表達量水平無顯著差異, 隨飼料淀粉水平的升高呈下降趨勢, 但各處理組差異不顯著(圖 4)。

3 討論

對魚類利用碳水化合物能力較低機制的探究主要圍繞2個方面, 一是消化道長短程度及淀粉酶分泌量較少; 二是胰島素和糖代謝酶不能產生適應性調節[19,20]。魚類生長、生理狀況、環境溫度和溶氧等均對碳水化合物的利用能力和機制產生一定的影響。

3.1 飼料淀粉對全養殖周期異育銀鯽魚“中科3號”后腸淀粉酶活性的影響

魚類淀粉酶主要分布于腸道組織, 后腸淀粉酶活性最高。有研究表明, 多種魚類糖酶活性隨魚類生長波動較大, 淀粉酶活性隨魚體生長呈階段性上升趨勢且會出現一個峰值[21—26]。本實驗研究也出現相似結果, 幼魚期D63異育銀鯽后腸淀粉酶活性水平較低且不隨飼料淀粉的變化而變化, 自養成前期D110之后異育銀鯽后腸淀粉酶活性及敏感度顯著增強。

3.2 飼料淀粉對全養殖周期異育銀鯽魚“中科3號”糖代謝酶活性及基因表達的影響

魚類攝食含淀粉飼料后血糖濃度升高, 糖轉運載體將血液中的葡萄糖轉入組織中進行物質轉化和能量循環[27,28]。肝臟是魚體進行糖代謝的主要器官, 糖代謝過程主要包括糖酵解和糖異生, 葡萄糖經過己糖激酶(HK)、葡萄糖激酶(GK)、6-磷酸果糖激酶(PFK)和丙酮酸激酶(PK)等糖酵解關鍵酶的作用轉化為丙酮酸進入三羧酸循環從而轉化為脂肪, 脂肪經過三羧酸循環形成的丙酮酸也可通過丙酮酸羧化酶(PCK)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPCK)、果糖-1, 6-二磷酸酶(FBPase)和葡糖-6-磷酸酶(G6PC)等糖異生關鍵酶的作用重新合成葡萄糖[29—32]。幼魚期D63異育銀鯽glut2 mRNA相對表達量無顯著差異, 其他階段異育銀鯽glut2 mRNA相對表達量水平隨飼料淀粉水平升高而升高。各生長階段異育銀鯽糖酵解的敏感度高于糖異生代謝。

圖 1 飼喂不同淀粉水平飼料后異育銀鯽后腸淀粉酶活性的變化Fig. 1 Amylase activities in hindgut of gibel carp fed with different starch diets

圖 2 飼喂不同碳水化合物水平飼料異育銀鯽血糖濃度(A)和血漿膽固醇(B)濃度變化Fig. 2 Plasma glucose (A) and cholesterol (B) of gibel carp fed with different starch diets

圖 3 飼喂不同淀粉水平飼料后異育銀鯽肝糖原(A)和肌糖原(B)的變化Fig. 3 The levels of hepatic glycogen (A) and muscle glycogen (B) in gibel carp fed with different starch diets

圖 4 飼喂不同淀粉水平飼料后異育銀鯽肝臟糖代謝相關基因mRNA相對表達量的變化Fig. 4 Relative expression of hepatic glucose metabolism related genes of gibel carp fed with different starch diets

3.3 全養殖周期異育銀鯽魚“中科3號”的糖需求

對于魚類全養殖周期不同階段糖需求及糖代謝差異的整體研究非常少。本實驗結果顯示不同生長階段異育銀鯽對飼料淀粉的需求差異較大, 越冬后異育銀鯽糖利用能力顯著高于越冬前。其中幼魚期D63異育銀鯽適宜飼料碳水化合物水平為23%; 養成前期D110異育銀鯽適宜飼料淀粉水平減為13%。越冬后D275組異育銀鯽整體代謝旺盛,43%淀粉組生長最好; 而養成中后期D340異育銀鯽飼料淀粉需求則再次降到33%。

在本研究中, 異育銀鯽越冬階段沒有投喂飼料,魚體沒有出現體重降低的現象是由于本實驗在長江故道江段上進行, 而異育銀鯽是雜食性魚類, 在越冬期攝食了水體中藻類等生物性餌料, 所以沒有表現出越冬期體重下降, 此結果與實驗室前期在相同地點的異育銀鯽越冬期生長結果相一致[33]。越冬期異育銀鯽生長表現變化趨勢與養成前期變化趨勢相一致, 和越冬前生長較好的魚體在攝食上占有優勢緊密相關, 進而在越冬期間表現出一致的生長優勢。

綜上所述, 幼魚期異育銀鯽可能由于魚體代謝系統發育不完善, 腸道淀粉酶活性及糖代謝各環節對飼料淀粉水平變化應答不敏感進而導致利用飼料淀粉的能力較弱, S23處理組生長表現最好。養成前期異育銀鯽機體功能更為完善, 糖代謝應答機制敏感, 其糖利用能力依然不強可能是由于季節變化帶來的環境脅迫所致。幼魚期和養成前期魚體生長表現和脂肪積累趨勢相一致, 推測是這一階段魚體生長快速所致。越冬后階段異育銀鯽由于生長代償作用, 異育銀鯽整體代謝水平較高, 糖代謝應答機制敏感且糖利用能力較強, S43處理組生長表現最好。在養成中后期異育銀鯽魚體機能趨近完善, 對飼料碳水化合物的利用能力較高, 其生長性能和蛋白積累趨勢相一致均在S33處理組表現最好, 暗示淀粉通過其他途徑產生了蛋白節約的作用。異育銀鯽生長各階段糖酵解調節機制敏感, 糖異生調節不敏感, 其具體原因有待進一步探究。