Mito-Tempo在LPS誘導的肺動脈內皮細胞損傷中的作用*

張立新，王曉穎，和思燏，白君娥，朱祥瑞，梅 健，馬 翠△

（1哈爾濱醫科大學大慶分校醫學檢驗與技術學院，2黑龍江省慢性病基礎研究與健康管理重點實驗室，黑龍江大慶163319；3哈爾濱醫科大學藥學院，黑龍江哈爾濱150081）

肺動脈高壓（pulmonary hypertension，PH）是一種與炎癥相關的進行性血管損傷性疾病，其病理特性主要是持續性的肺血管收縮，肺循環阻力增強，右心室肥厚，最終導致右心衰竭和死亡［1-3］。PH的發病機制與肺動脈內皮細胞（pulmonary arterial endothelial cells，PAECs）的不穩定有關，在病理狀態下內皮細胞能釋放大量活性氧簇（reactive oxygen species，ROS），可通過調節不同類型的激酶和磷酸化酶，促進黏附連接蛋白和肌動蛋白的細胞骨架磷酸化，導致血管內皮細胞通透性增加，引起內皮細胞及血管損傷［4-6］。線粒體動態變化參與內皮細胞的多個生理進程如細胞內的鈣平衡、ATP生成、ROS產生及氧化應激，其中線粒體產生的ROS是誘導內皮細胞炎癥反應的主導因素，在維持內皮細胞功能的穩定性方面扮演著重要角色［7-10］。Mito-Tempo是具有超氧化物和烷基自由基清除特性的線粒體靶向抗氧化劑，其在PH中的作用，特別是能否減輕PAECs的功能障礙仍有待研究。本研究擬通過構建脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）誘導的PAECs炎癥損傷模型，探討Mito-Tempo對PAECs的保護作用及其分子機制。

材料和方法

1 主要試劑

Tempol和Mito-Tempo購于Enzo Life Sciences；MTT、RIPA蛋白裂解液、HRP標記的山羊抗兔IgG、HRP標記的山羊抗小鼠和GreenNuc?活細胞caspase-3活性檢測試劑盒購于碧云天生物技術有限公司；Transwell小室和Matrigel購于BD；抗發動蛋白相關蛋白1（dynamin-related protein 1，Drp1）、p-Drp1和電壓依賴性陰離子通道（voltage-dependent anion channel，VDAC）抗體購于Abcam；四甲基羅丹明甲酯（tetramethylrhodamine methyl ester，TMRM）與MitoSOX購于Thermo Fisher。

2 實驗方法

2.1 牛PAECs的原代培養與鑒定本研究獲得哈爾濱醫科大學倫理委員會的批準。取新生小牛肺臟放于超凈臺內，手術剪分離出肺主動脈，放置在HEPES緩沖液中清洗，使用手術刀片輕輕地刮下肺主動脈內皮層，放入膠原酶中消化30 min，1×PBS洗掉膠原酶，用含20%胎牛血清的DMEM培養液培養，置于37℃、5%CO2條件的培養箱中，3 d后觀察細胞生長情況，待細胞長到80%左右傳代，進行后續實驗。通過顯微鏡下細胞形態特征和細胞免疫熒光染色檢測內皮標志物CD31來鑒定PAECs。

2.2 MTT實驗將密度為每孔5 000個細胞的PAECs接種到96孔培養板中并置于37℃、5%CO2的條件下培養，待細胞長到80%左右時饑餓處理過夜，按實驗分組進行相應處理，繼續培養24 h，向細胞中加入含有0.5%MTT的無色培養基，避光溫育4～6 h，棄去培養液并向細胞中加入150μL DMSO，振蕩，10 min后終止反應，用酶標儀測定波長490 nm處的吸光度（A）。

2.3 細胞劃痕實驗將處于對數生長期的PAECs接種到6孔培養板中并置于37℃、5%CO2的條件下培養，待細胞長滿，饑餓處理過夜，用100～200μL移液管槍頭輕劃出一道1 mm寬痕，1×PBS清洗后按實驗分組進行相應處理，在0 h和24 h后對相同的劃痕區域進行拍照。

2.4 Transwell實驗將濾膜孔徑為8μm的Boyden小室置于24孔培養板中，小室下層加入5%FBSDMEM培養基。將處理好的PAECs用胰蛋白酶消化處理并重懸于無血清培養液中，然后按照細胞數為每孔8×104接種到Boyden小室上室中，加藥處理后置于37℃、5%CO2條件下培養24 h。隨后取出小室，用棉簽輕檫掉小室上層未遷移的細胞。將遷移細胞用4%多聚甲醛室溫固定15 min，0.4%結晶紫染色10 min，蒸餾水清洗3遍，顯微鏡觀察并拍照計數。

2.5 小管形成實驗在96孔培養板中加入30μL提前融化成液體的Matrigel，并在37℃下固化30 min。將PAECs用胰蛋白酶消化處理并制成濃度為5×107/L的細胞懸液，吸取200μL細胞懸液接種于每個孔中，按實驗分組進行相應處理后置于37℃、5%CO2條件下培養24 h。顯微鏡下觀察小管形成后拍照，Image-Pro Plus 6.0軟件測定小管長度。

2.6 MitoSox與TMRM染色將按實驗分組進行相應處理后的PAECs與MitoSOX?Red線粒體超氧化物指示劑（5μmol/L）或TMRM（0.1μmol/L）37℃避光孵育20～30 min，PBS清洗3遍。使用尼康TE2000顯微鏡觀察拍照（激發波長514 nm/發射波長585 nm）。

2.7 線粒體形態及氧化狀態檢測將線粒體靶向表達氧化還原反應敏感性GFP的Mito-roGFP轉染細胞，作用24 h后使用激光共聚焦顯微鏡拍照觀察線粒體形態。將獲得的圖像使用ImageJ軟件進行線粒體片段化量化分析，以線粒體片段化指數（mitochondrial fragmentation index，MFI）表示。使用多邊形選擇工具選擇單個的細胞，復制并轉移到新的獨立圖像文件中。轉換線粒體圖像為8位灰度圖像。調整合適的圖像閾值，使線粒體的成像明顯區別于背景。將圖像轉換為二值圖像，計算非連續的線粒體片段的數量和線粒體中的像素數量。MFI的計算方法是將非相鄰片段數除以像素數，再乘以1 000［11］。為了確定細胞的氧化還原狀態，細胞分別給予405 nm和488 nm波長激發光激發，隨后于525 nm波長處獲取熒光照片。每分鐘對單個細胞進行成像，持續30 min，并測量405 nm（氧化）和488 nm（還原）熒光強度的比值以確定每個細胞的相對氧化還原狀態。

2.8 細胞免疫熒光觀察將預先處理好的細胞使用1×PBS清洗3遍，4%多聚甲醛4℃固定15 min，1×PBS清洗3遍，0.01%Triton X-100室溫孵育細胞10 min透化細胞膜，1×PBS緩沖液清洗3遍，5%BSA封閉細胞30 min后，將Ⅰ抗（抗Drp1抗體，1∶50）滴加到細胞上，4℃孵育過夜。第2天PBS清洗3遍，Ⅱ抗（Cy3）37℃避光孵育2 h，1×PBS清洗3遍，DAPI避光室溫染核10 min，PBS緩沖液清洗3遍。使用尼康TE2000顯微鏡觀察拍照。

2.9 Western blot實驗將預先處理好的細胞使用PBS緩沖液清洗3遍，吸盡PBS緩沖液，加入帶有PMSF的蛋白裂解液，冰上孵育15 min，刮刀收集細胞裂解液，4℃、13 500 r/min離心15 min，吸取上清液即是細胞總蛋白。取30～50μg蛋白樣品，按照每100μL蛋白加入25μL 5×SDSLoading Buffer，混勻，放在100℃煮樣器中5 min，-80℃保存。按照實驗分組加入不同的蛋白樣品和蛋白Marker，10%Tris-HCl SDS聚丙烯酰胺凝膠上分離，并轉移到硝酸纖維素膜上轉膜2 h，按照分子量剪膜后5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，4℃孵育Ⅰ抗（抗β-actin抗體，1∶1 000；抗Drp1和p-Drp1抗體，1∶500）過夜。第2天孵育不同比例的Ⅱ抗（HRP標記的山羊抗兔IgG和HRP標記的山羊抗小鼠IgG，1∶5 000～1∶10 000），室溫孵育1 h。用ECL工作液室溫孵育NC膜5 min后顯影使用ImageJ軟件分析目的蛋白相對密度。

2.10 caspase-3活性的檢測將密度為每孔5 000個細胞的PAECs接種到96孔培養板中并置于37℃、5%CO2的條件下培養，待細胞長到80%左右時饑餓處理過夜，按實驗分組進行相應處理繼續培養24 h。按照GreenNuc?活細胞caspase-3活性檢測試劑盒說明書要求進行樣品處理，用酶標儀測定波長490 nm處的A值。

3 統計學處理

用SPSS 16.0統計軟件進行分析。所有數據均采用均數±標準誤（mean±SEM）表示。兩組間比較采用t檢檢，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 LPS誘導PAECs損傷，凋亡增加

MTT實驗檢測不同濃度（0、0.1、1和5 mg/L）的LPS作用24 h對PAECs活力的影響，結果表明LPS濃度為1 mg/L時，細胞開始出現明顯損傷，見圖1A。同時通過caspase-3活性測定實驗檢測不同濃度（0、0.1、1和5 mg/L）的LPS作用24 h對PAECs凋亡的影響，結果顯示細胞凋亡程度隨著LPS濃度的升高而顯著增強，見圖1B。綜合以上兩個實驗結果選定1 mg/L LPS為后續實驗條件。

Figure 1.LPSinduced apoptosis of PAECs.A：the viability of PAECs after treatment with different concentrations of LPSfor 24 h was detected by MTT assay；B：the apoptosis of PAECs after treatment with different concentrations of LPSfor 24 h was measured by caspase-3 activity detection assay.Mean±SEM.n=6.*P＜0.05，**P＜0.01 vs0 mg/L group.圖1 LPS誘導凋亡，促進PAECs損傷

2 LPS誘導PAECs氧化應激及線粒體功能異常

PAECs轉染Mito-roGFP腺病毒后檢測細胞線粒體形態和氧化狀態，如圖2A所示，LPS誘導細胞線粒體分裂，線粒體片段化增加，同時促進線粒體氧化應激。線粒體膜電位測定結果顯示，LPS導致PAECs的線粒體去極化，見圖2B。同時線粒體ROS熒光探針MitoSOX染色結果顯示，LPS誘導線粒體中ROS產量增加，見圖2C。以上實驗結果表明，LPS誘導氧化應激，損傷PAECs的線粒體形態和功能。

Figure 2.LPSinduced oxidative stress and mitochondrial dysfunction of PAECs.A：mitochondrial fission［indicated by mitochondrial fragmentation index（MFI）］and oxidative status（indicated by the ratio of fluorescence at 405/488 nm）of PAECs induced by LPSwere detected after infection with Mito-roGFP；B：tetramethylrhodamine methyl ester（TMRM）staining was used to assess mitochondrial polarization；C：representative images of mitochondrially targeted superoxide indicator Mito-SOX staining.Mean±SEM.n=5.**P＜0.01 vs control（CON）group.圖2 LPS誘導PAECs氧化應激及線粒體功能異常

3 Mito-Tempo抑制LPS誘導的PAECs氧化應激及線粒體功能損傷

為了探究抗氧化劑Tempol和Mito-Tempo是否能夠緩解LPS誘導的PAECs氧化應激及線粒體損傷，分別給予細胞Tempol及Mito-Tempo（10 mmol/L）處理［11］，Mito-roGFP腺病毒轉染結果顯示，Mito-Tempo明顯抑制了LPS誘導的細胞線粒體片段化和氧化應激，但Tempol抑制效果相對較弱，見圖3A。另外，我們發現LPS+Mito-Tempo組的線粒體去極化水平較LPS組顯著下降，而LPS+Tempol組的線粒體去極化水平無明顯變化，見圖3B。MitoSOX結果表明，使用Mito-Tempo處理細胞后，與LPS組相比，細胞內ROS水平明顯下降，見圖3C。以上實驗結果說明Mito-Tempo明顯減輕LPS誘導的PAECs氧化應激及線粒體形態和功能損傷。

4 Mito-Tempo抑制LPS激活的Drp1磷酸化

為了確定LPS誘導的線粒體功能障礙是否與Drp1激活有關，我們采用細胞免疫熒光實驗，紅色熒光標記Drp1，綠色熒光標記線粒體標志蛋白VDAC。結果顯示，Drp1在胞質及線粒體中大量分布，且LPS促進Drp1的表達，Tempol和Mito-Tempo處理可降低Drp1的表達水平，見圖4A。同時，Western blot實驗結果發現，Tempol和Mito-Tempo處理抑制了LPS導致的Drp1和p-Drp1蛋白水平升高，其中Mito-Tempo的抑制效果更為顯著，見圖4B。

5 Mito-Tempo減輕LPS誘導的PAECs凋亡

MTT實驗檢測結果表明，與LPS組相比，LPS+Mito-Tempo組的細胞活力明顯增加（P＜0.05），LPS+Tempol組的細胞活力無明顯改變，見圖5A。同時caspase-3活性檢測實驗結果顯示，與LPS組相比，LPS+Mito-Tempo組的細胞損傷減輕，但Tempol處理不能抑制細胞凋亡，見圖5B。以上實驗證明Mito-Tempo可顯著抑制LPS引起的PAECs損傷。

6 Mito-Tempo抑制LPS導致的PAECs功能異常

Figure 3.Mito-Tempo（Mito-T）inhibited LPS-induced oxidative stress and mitochondrial dysfunction of the PAECs.A：the effect of Tempol（T）or Mito-T（10 mmol/L）on mitochondrial fission and oxidative status；B：the effect of Tor Mito-T（10 mmol/L）on mitochondrial polarization induced by LPS；C：MitoSOX staining was used to detect the effect of Tor Mito-T（10 mmol/L）on ROSproduction induced by LPS.Mean±SEM.n=5.**P＜0.01 vs control（CON）group；#P＜0.05 vs LPSgroup.圖3 Mito-Tempo抑制LPS誘導的PAECs的氧化應激及線粒體功能損傷

PAECs的功能異常會導致其遷移及管腔形成功能受損［12］。劃痕實驗結果顯示，經LPS誘導24 h后PAECs的遷移能力下降，劃痕愈合程度明顯低于正常組；Tempol和Mito-Tempo處理組較LPS組劃痕愈合程度有所增加，且Mito-Tempo作用更為顯著（P＜0.01），見圖6A。Transwell實驗結果顯示，LPS誘導細胞穿過小室的數量明顯少于正常組；LPS+Mito-Tempo組的細胞遷移能力有所增加；LPS+Tempol處理組與LPS組相比無明顯改變，見圖6B。小管形成實驗表明，LPS刺激縮短了管腔形成長度；與LPS處理組相比，LPS+Mito-Tempo組的小管形成長度明顯得到恢復，LPS+Tempol處理組的小管形成長度無恢復，見圖6C。以上結果說明Mito-Tempo能明顯抑制LPS導致的PAECs功能異常。

討 論

血管內膜層的內皮細胞穩態破壞在PH肺血管重構的發展過程中發揮著重要作用［13］。在正常狀態下，內皮細胞通過一種肌-內皮連接方式維護著平滑肌細胞的穩定，內皮細胞完整性對于維持血管正常的生理結構及功能具有重要的意義［14］。PH病變發生時，內皮細胞在通透性、抗凝作用和炎癥反應等方面均發生顯著變化，從而損傷了肺血管內皮細胞的結構和功能［15］。大量研究表明，炎癥反應是導致PH發生發展的重要因素，一方面附著在內皮細胞上的炎癥細胞可分泌大量炎癥因子，從而導致內皮損傷；另一方面炎癥細胞分泌的生長因子和趨化因子能促進平滑肌細胞的過度增殖和凋亡抑制，進而促進了PH的發展［16-17］。本研究發現LPS刺激PAECs導致細胞凋亡、遷移及管腔形成能力受損，進而對內皮細胞功能損傷的分子機制展開探索。

線粒體在細胞的正常生命進程中起著決定性作用，它參與細胞內各種信號的傳遞，調節細胞內氧化應激反應以及細胞增殖和凋亡過程［18-20］。大量研究表明Drp1是調控線粒體穩態的關鍵蛋白，炎癥及缺氧等多種因素可導致Drp1的異常表達［21-22］。在病理條件下，細胞產生大量ROS，而ROS大部分來源于線粒體，線粒體內ROS的聚集會損傷線粒體的結構和功能，同時Drp1的表達及磷酸化增多，共同導致內皮細胞功能障礙［23-24］。因此，線粒體形態和功能異常是導致血管內皮受損的重要誘因。我們的前期研究顯示線粒體ROS與Drp1的正反饋調節作用誘導缺氧性PAECs增殖，提示線粒體ROS與Drp1在PH疾病發病機制中具有重要作用。

Figure 4.Mito-Tempo（Mito-T）inhibits Drp1 expression and phosphorylation activated by LPS.A：the effect of Tempol（T）or Mito-T（10 mmol/L）on fluorescence of Drp1 induced by LPS；B：the effect of T or Mito-T（10 mmol/L）on the protein levels of Drp1 and p-Drp1 induced by LPS.Mean±SEM.n=6.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control（CON）group；#P＜0.01，##P＜0.01 vs LPSgroup.圖4 Mito-Tempo抑制LPS激活的Drp1表達和磷酸化

Figure 5.Mito-Tempo（Mito-T）attenuated apoptosis of PAECs induced by LPS.A：the effect of Tempol（T）or Mito-T（10 mmol/L）on the viability of PAECs induced by LPS；B：the effect of Tor Mito-T（10 mmol/L）on the apoptosis of PAECs induced by LPS.Mean±SEM.n=6.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control（CON）group；#P＜0.05 vs LPSgroup.圖5 Mito-Tempo減輕LPS誘導的PAECs凋亡

Figure 6.Mito-Tempo（Mito-T）inhibited the dysfunction of PAECs caused by LPS.A and B：scratch assay and Transwell method were used to detect the effect of Tempol（T）or Mito-T（10 mmol/L）on the migration ability of PAECs induced by LPS；C：the effect of Tor Mito-T（10 mmol/L）on the tube formation ability of PAECs induced by LPS.Mean±SEM.n=6.**P＜0.01 vs control（CON）group；##P＜0.01 vs LPSgroup.圖6 Mito-Tempo抑制LPS導致的PAECs功能異常

Mito-Tempo是線粒體靶向抗氧化劑，其結構中含有氮自由基，具有類似于超氧化物歧化酶的活性，起到抗氧化應激的作用，同時易于轉化成具有清除氧自由基作用的羥胺結構，進一步增加了其自身的抗氧化能力［25-26］。既往研究表明，Mito-Tempo在神經退行性疾病、糖尿病、心血管疾病等炎性疾病中都有一定的治療效果，但其對于PH機制是否具有調控作用仍未明確［27-29］。

本研究證實LPS所致PAECs的功能障礙與線粒體穩態失衡密切相關。使用LPS刺激內皮細胞后，細胞線粒體分裂增多、氧化性增強、去極化水平升高、ROS產量增加以及Drp1表達活化增多；而給予Mito-Tempo處理能抑制LPS所致的線粒體分裂增多，并抑制氧化應激、線粒體去極化水平、ROS產量及Drp1表達和磷酸化，改善內皮細胞功能。根據以上研究結果，我們認為Mito-Tempo對內皮細胞具有保護作用，其機制可能依賴于Mito-Tempo的抗氧化應激能力，維持線粒體穩態，保護細胞免受氧化損傷。本實驗初步探討了Mito-Tempo對內皮細胞的保護作用及其分子機制，但體內實驗中Mito-Tempo是否具有抑制PH發生發展的作用仍需要在未來的實驗中加以驗證。