索拉非尼聯(lián)合伊匹單抗對(duì)肝癌抑制作用的實(shí)驗(yàn)研究

李延玲，陸蒂青，李金妞，郭杰，盧瑞杰，霍麗亞#

南陽(yáng)市中心醫(yī)院1感染科，2兒科，3門診部，4感染疾病科，河南南陽(yáng)473000

肝癌是一種常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤，在全球范圍內(nèi)肝癌發(fā)病率居第六位，病死率居第四位，嚴(yán)重威脅人民的身心健康。索拉非尼（sorafenib）是首個(gè)經(jīng)美國(guó)食品藥品管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）批準(zhǔn)用于臨床治療肝癌的靶向分子化療藥物，是一種多激酶抑制性藥物，能夠通過(guò)靶向調(diào)控多條信號(hào)通路抑制肝癌細(xì)胞增殖、新生血管生成及侵襲、轉(zhuǎn)移，且療效顯著，預(yù)后效果良好。伊匹單抗是最早被美國(guó)FDA批準(zhǔn)用于臨床治療腫瘤的免疫檢查點(diǎn)抑制劑，可與其他化療方案聯(lián)合應(yīng)用，對(duì)肝癌具有顯著的治療效果。本研究探討索拉非尼聯(lián)合伊匹單抗對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、侵襲的影響及相關(guān)機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑與儀器

HepG2肝癌細(xì)胞購(gòu)自上海細(xì)胞庫(kù)。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白濃度測(cè)定試劑盒、兔抗絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MEK）、p-MEK1多克隆抗體均購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；兔抗Raf-1、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）1、p-ERK1及甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）多克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。Multiskan FC酶標(biāo)儀購(gòu)自Thermo Fisher公司；ChemiDocTM XRS凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)伯樂(lè)公司。

1.2 CCK- 8法檢測(cè)細(xì)胞活力

將肝癌HepG2細(xì)胞接種于96孔板，培養(yǎng)24 h，設(shè)置索拉非尼組、伊匹單抗組及聯(lián)合組，分別加入不同濃度的索拉非尼（5、10、15、20 μmol/L）、伊匹單抗（5、10、15、20 μmol/L）及兩藥（10 μmol/L索拉非尼+10 μmol/L伊匹單抗），設(shè)置空白對(duì)照組；每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)48 h，加入10 μl的CCK-8溶液，在37℃、5% CO培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h，取出培養(yǎng)板，于酶標(biāo)儀波長(zhǎng)450 nm處測(cè)各復(fù)孔吸光度值。

1.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

以 10 μmol/L 索拉非尼（10 μmol/L 索拉非尼組）、10 μmol/L伊匹單抗（10 μmol/L伊匹單抗組）及兩藥聯(lián)合（聯(lián)合組）分別作用于肝癌細(xì)胞，并設(shè)立對(duì)照組，培養(yǎng)細(xì)胞48 h。收集（1～3）×10個(gè)細(xì)胞，加1 ml磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）1500 r/min離心3 min，洗兩遍。用雙蒸水將5×Binding Buffer稀釋為1×Binding Buffer。取300 μl預(yù)冷的1×Binding Buffer重懸細(xì)胞。每管各加入3 μl膜聯(lián)蛋白V（Annexin V）-異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）和 5 μl碘化丙啶（propidium iodide，PI）。輕微混勻后，室溫避光孵育10 min。再向每管中加入200 μl預(yù)冷的1×Binding Buffer，混勻后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.4 Transwell法檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力

采用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液稀釋Matrigel膠，并以每孔400 μl均勻平鋪于Transwell上室，去除氣泡，并于培養(yǎng)箱中孵育30 min，待其凝固備用。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞消化、計(jì)數(shù)，并取2 ml濃度為5×10/ml的細(xì)胞于Transwell上室，Transwell下室加入3 ml含10%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液，Transwell板于37℃、5% CO培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，將上室取出，用棉簽將膜表面殘留擦去，吸取培養(yǎng)液，并用PBS清洗，甲醇固定20 min，去除甲醇，加入0.1%結(jié)晶紫染色20 min，PBS洗滌，顯微鏡下觀察并拍照記錄，取4個(gè)視野細(xì)胞數(shù)平均值。

1.5 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測(cè)細(xì)胞中蛋白表達(dá)情況

收集細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液于4℃搖床上作用細(xì)胞30 min，后用移液槍反復(fù)吹打細(xì)胞約20次，4℃、12 000 r/min離心10 min，收集上清液。測(cè)定蛋白濃度并加入上樣緩沖液煮沸變性，蛋白樣品上樣后，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），直至目的蛋白分離，轉(zhuǎn)聚偏氟乙烯膜30 min。5%脫脂奶粉室溫下封閉1 h，一抗工作溶液4℃過(guò)夜孵育，次日室溫孵育二抗，將化學(xué)發(fā)光試劑加于膜上，于凝膠成像系統(tǒng)中曝光，并分析Raf-1、p-MEK1、p-ERK1目的蛋白條帶灰度值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 索拉非尼對(duì)HepG 2肝癌細(xì)胞活力的影響

不同濃度索拉非尼處理HepG2細(xì)胞，隨著濃度增加，細(xì)胞吸光度值及增殖率均下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

﹤0.05）。（表1）

表1 索拉非尼對(duì)HepG 2肝癌細(xì)胞活力的影響（± s）

2.2 伊匹單抗對(duì)HepG 2肝癌細(xì)胞活力的影響

不同濃度伊匹單抗處理HepG2細(xì)胞，隨著濃度增加，細(xì)胞吸光度值及增殖率均下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

﹤0.05）。（表2）

表2 伊匹單抗對(duì)HepG 2肝癌細(xì)胞活力的影響（± s）

2.3 索拉非尼聯(lián)合伊匹單抗對(duì)HepG 2肝癌細(xì)胞活力的影響

10 μmol/L索拉非尼組、10 μmol/L伊匹單抗組以及聯(lián)合組的細(xì)胞增殖率分別為（49.83±0.4）%、（45.53±0.8）%、（33.57±0.9）%，分別低于對(duì)照組的100%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

t

=6.423、8.470、9.651，

P

﹤0.05）。

2.4 索拉非尼聯(lián)合伊匹單抗對(duì)HepG 2肝癌細(xì)胞凋亡、侵襲能力的影響

與對(duì)照組比較，10 μmol/L索拉非尼組、10 μmol/L伊匹單抗組及聯(lián)合組細(xì)胞侵襲數(shù)目均明顯減少，凋亡率均明顯提高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

﹤0.01）；與10 μmol/L索拉非尼組和10 μmol/L 伊匹單抗組比較，聯(lián)合組細(xì)胞侵襲數(shù)目均明顯減少，凋亡率均明顯提高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

﹤0.01）。（圖1、表3）

圖1 各組HepG 2肝癌細(xì)胞的侵襲能力（結(jié)晶紫染色，×200）

表3 各組HepG 2肝癌細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞侵襲數(shù)目的比較（± s）

2.5 索拉非尼聯(lián)合伊匹單抗對(duì)HepG 2肝癌細(xì)胞中Raf/MEK/ERK信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況的影響

與對(duì)照組比較，10 μmol/L索拉非尼組、10 μmol/L伊匹單抗組及聯(lián)合組細(xì)胞中Raf-1、p-MEK1、p-ERK1蛋白表達(dá)量均明顯下調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

﹤0.01）；與10 μmol/L索拉非尼組及10 μmol/L伊匹單抗組比較，聯(lián)合組細(xì)胞中Raf-1、p-MEK1、p-ERK1蛋白表達(dá)量均明顯下調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

﹤0.01）。（表4）

表4 各組HepG 2肝癌細(xì)胞中Raf- 1、p-MEK 1、p-ERK 1蛋白表達(dá)量的比較（± s）

3 討論

索拉非尼是FDA首個(gè)批準(zhǔn)用于肝癌的靶向分子藥物，在肝癌的臨床治療中效果顯著，而且聯(lián)合其他治療方案治療效果優(yōu)于單獨(dú)給藥。在肝癌細(xì)胞的抑制作用效果上也發(fā)現(xiàn)了索拉非尼與其他藥物聯(lián)合使用的優(yōu)勢(shì)，如索拉非尼聯(lián)合辛二酰苯胺異羥肟酸可顯著抑制MHCC97L細(xì)胞生長(zhǎng)并誘導(dǎo)其凋亡，機(jī)制可能與上調(diào)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡通路中CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白（CCAAT-enhancer-binding protein homologous protein，CHOP）的表達(dá)有關(guān)。索拉非尼與蘿卜硫素聯(lián)合應(yīng)用對(duì)HepG2細(xì)胞具有協(xié)同抗腫瘤作用，機(jī)制可能與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及抑制核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號(hào)通路活化有關(guān)。姜黃素聯(lián)合索拉非尼組抑制肝癌HepG2細(xì)胞增殖作用較單藥組明顯增強(qiáng)，兩藥聯(lián)合協(xié)同誘導(dǎo)肝癌HepG2細(xì)胞產(chǎn)生自噬，其作用機(jī)制可能與抑制磷脂酰肌醇-3-羥激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又稱AKT）/雷帕霉素靶 蛋白（mechanistic target of rapamycin kinase，MTOR）信號(hào)通路有關(guān)。伊匹單抗是最早被美國(guó)FDA批準(zhǔn)用于臨床治療腫瘤的免疫檢查點(diǎn)抑制劑，在肝癌的治療中效果顯著。本研究首先采用CCK-8法檢測(cè)不同濃度索拉非尼（5、10、15、20 μmol/L）、不同濃度伊匹單抗（5、10、15、20 μmol/L）對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞活力的影響，結(jié)果表明索拉非尼、伊匹單抗均能顯著抑制肝癌細(xì)胞增殖，且具有濃度依賴性，而且聯(lián)合組的抑制效果優(yōu)于單獨(dú)給藥。另外細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞侵襲數(shù)目的檢測(cè)結(jié)果也表明索拉非尼、伊匹單抗單獨(dú)給藥能顯著誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡，減少細(xì)胞侵襲數(shù)目，且聯(lián)合組的抑制效果優(yōu)于單獨(dú)給藥，說(shuō)明索拉非尼及伊匹單抗聯(lián)合應(yīng)用對(duì)肝癌患者的治療效果可能更佳。

Raf/MEK/ERK是一條經(jīng)典的絲氨酸蘇氨酸蛋白酶途徑，能夠通過(guò)三級(jí)激酶模式，將上游信號(hào)傳遞給下游蛋白，最終調(diào)控蛋白表達(dá)。Raf是Raf/MEK/ERK信號(hào)通路的關(guān)鍵因子，Raf激酶的調(diào)控涉及與其他信號(hào)通路的整合、多位點(diǎn)的磷酸化過(guò)程，特別是在細(xì)胞增殖、凋亡及分化過(guò)程中扮演重要角色。MEK包括MEK1和MEK2，是既具有酪氨酸蛋白激酶活性，又具有絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性的激酶，當(dāng)上游Raf激酶被活化后，活化的Raf可與MEK1/2結(jié)合，使MEK1/2雙重磷酸化，進(jìn)而激活下游ERK。活化的ERK進(jìn)入細(xì)胞核，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞增殖。研究已經(jīng)顯示Raf/MEK/ERK信號(hào)通路在肝癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中被高度激活，阻斷此信號(hào)通路能夠顯著抑制肝癌細(xì)胞的增殖、侵襲、血管生成等生物學(xué)行為。目前研究認(rèn)為索拉非尼通過(guò)調(diào)控Raf/MEK/ERK信號(hào)通路，減少細(xì)胞周期蛋白、血管生長(zhǎng)因子表達(dá)，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞增殖，提示索拉非尼對(duì)Raf/MEK/ERK信號(hào)通路的調(diào)控作用。因此本研究繼續(xù)探討索拉非尼、伊匹單抗單獨(dú)或聯(lián)合給藥對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞中Raf/MEK/ERK信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)量的影響，結(jié)果表明索拉非尼、伊匹單抗及聯(lián)合給藥均能顯著下調(diào)Raf-1、p-MEK1、p-ERK1蛋白表達(dá)，且聯(lián)合給藥抑制作用優(yōu)于單獨(dú)給藥。

綜上所述，不同濃度的索拉非尼、伊匹單抗對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞的增殖均具有顯著抑制作用，且呈濃度依賴性，單獨(dú)給藥、聯(lián)合給藥均能顯著抑制肝癌HepG2細(xì)胞增殖與侵襲，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，此過(guò)程可能與抑制Raf-1/MEK1/ERK1信號(hào)通路有關(guān)，且聯(lián)合給藥組優(yōu)于單獨(dú)給藥，提示在臨床肝癌治療中可以考慮二者聯(lián)合給藥，治療效果可能更佳。