鐵皮石斛WOX轉錄因子的鑒定和分析

曾丹琦, 張明澤, 何春梅, 王浩斌, 俞振明, 司燦, 趙聰慧,李冬妹, 段俊*

鐵皮石斛WOX轉錄因子的鑒定和分析

曾丹琦1,2, 張明澤1,2, 何春梅1, 王浩斌1,2, 俞振明1, 司燦1,2, 趙聰慧1,2,李冬妹3, 段俊1*

(1. 中國科學院華南植物園，廣東省應用植物學重點實驗室，中國科學院華南農業植物分子分析與遺傳改良重點實驗室，廣州 510650；2. 中國科學院大學，北京 100049；3. 順德職業技術學院，廣東 佛山 528300)

為了解鐵皮石斛() WOX轉錄因子的功能，采用全基因組分析技術對鐵皮石斛WOX家族成員進行鑒定，并進行生物信息學和表達模式分析。結果表明，鐵皮石斛基因組中有9個WOX轉錄因子(DoWOX 1DoWOX 9)，大部分的含有2～3個外顯子，啟動子含有與激素誘導、逆境脅迫和生長發育有關的順式作用元件。qPCR分析表明，、、、和在類原球莖中的表達量最高，在小花蕾中表達最高, 隨著花的發育，表達呈現下降趨勢。此外，、和在合蕊柱上的表達量最高，而在唇瓣的表達量最高。因此，可能參與調控鐵皮石斛的生長發育，且可能在維持類原球莖狀態和花的發育中起重要作用。

鐵皮石斛；WOX轉錄因子；生物信息學；基因表達；qPCR

植物展示出非凡的再生能力，保證發育的可塑性。植物干細胞是未分化的細胞，位于分生組織, 未分化的狀態為穩定的遺傳性、較高的線粒體活性以及很強的分化和自我更新能力等奠定了基礎[1-2]，進而對環境變化信號快速響應和對植物發育進程參與調控[3]。植物細胞全能性在生物技術上具有廣泛的應用市場。目前對于植物的干細胞研究主要在擬南芥()等的莖尖干細胞[4-5]、水稻()等的根尖干細胞[6]上，植物干細胞發生機理在種苗生產、生物技術等領域扮演舉足輕重的角色。

WOX家族(WUSCHEL-related homeobox)是真核細胞homeobox (HB)超家族中的一員[7-8]。WOX轉錄因子具有“螺旋-環-螺旋-轉角-螺旋”的典型結構[8-9]，在植物發育過程中扮演重要的調控角色[10-11]，包括在植物干細胞維持、胚胎形成及莖干、根和花的發育等。有研究表明，在根和莖分生組織中干細胞生態位的發育上具有重要作用[11-12]；植物的胚胎發育是個復雜的過程，不僅受到運輸調控, 而且受到局部生長素反應的影響[13]，可以決定植物胚胎發育的細胞命運[12]；在根發育中,在不定根基源細胞中表達[12,14]以激活LBD16，進而保證根的正常發育；在形成層干細胞中，和其余WUS成員在干細胞維持中起重要作用[15-16]; WOX轉錄因子在花的結構和發育上具有重要的調控作用[17]，被認為是花干細胞維持必需的基因[17-18],在矮牽牛()和煙草()中是保證花器官結構正常的必需基因[19-20]。WUS家族蛋白成員可以分為3個進化支: 分別為WUS、Ancient和Intermediate[8]，但對其功能還不清楚。

鐵皮石斛()為蘭科(Orchi- daceae)石斛屬草本植物，有較高的藥用價值, 具有抗腫瘤、增加免疫力和益胃生津等功效[21-22]。由于對過度采挖導致野生資源大量減少，因此從分子水平研究鐵皮石斛的生長發育對保護其資源具有重大意義。目前關于WOX轉錄因子的功能研究主要在模式植物擬南芥和水稻上，對中藥材如鐵皮石斛[23-24]的相關研究鮮見報道。此外，蘭科植物的花在結構上高度特化，如具有形態特異的萼片、唇瓣和合蕊柱[25]。本研究根據已報道的鐵皮石斛基因組數據[26]，對其WOX家族進行鑒定和生物信息學分析，并分析基因在不同生長發育階段和花的不同組織中的表達模式，為探討WOX轉錄因子在調控鐵皮石斛生長發育中的作用提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料

鐵皮石斛()種植于中國科學院華南植物園苗圃。取約1 cm長的花蕾，分別收集萼片、花瓣、唇瓣和合蕊柱，液氮速凍15 min，保存于-80℃冰箱備用。

鐵皮石斛組培苗在1/2MS+0.1%活性炭+2%蔗糖+0.6%瓊脂培養基(pH 5.4)上培養，培養條件為(26±1)℃、32.57mol/(m2·s)、12 h光照/12 h黑暗, 相對濕度約為60%。采集的類原球莖、叢生芽(無根)和小苗(約3 cm高)經液氮速凍后保存于-80℃冰箱備用。

1.2 WOX轉錄因子家族成員的鑒定和序列分析

從NCBI (https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov)基因組數據庫下載鐵皮石斛基因組文件，利用Pfam、Swiss_Prot、eggNOG_class、NR注釋結果檢索WOX轉錄因子。然后對檢索到的WOX蛋白序列與擬南芥WOX蛋白序列進行比對，并構建進化樹，刪除同源性低且遺傳距離較遠，剩余基因即為鐵皮石斛。

1.3 多重序列比對和進化樹分析

采用DNAMAN8軟件對鐵皮石斛WOX家族成員的氨基酸序列進行比對。采用Clastal X version 2.0軟件對鐵皮石斛的WOX蛋白進行比對，輸出Fasta格式文件，導入MEGA，利用鄰接法(Neighbor- Joining)構建系統發育樹(NJ樹)，進行1 000次重復bootstrap統計學檢測。

1.4 WOX的生物信息學分析

從鐵皮石斛全基因組測序GFF文件中獲得的GFF注釋，利用GSDS在線軟件(http://gsds. cbi.pku.edu.cn/)繪制鐵皮石斛WOX家族成員的基因結構。利用在線工具MEME (http://alternate.meme- suite.org/tools/meme)搜索鐵皮石斛WOX基因家族成員的motif，用PlantCare在線軟件(http://bioinfor-matics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)預測啟動子中的順式作用元件，并用TBtools制圖。

1.5 RNA的提取和反轉錄

參照柱式植物RNAOut 2.0試劑盒(北京天恩澤基因科技有限公司)說明書，分別提取鐵皮石斛不同發育時期(類原球莖、叢生芽和小苗)和花的不同組織(萼片、花瓣、唇瓣和合蕊柱)的總RNA。提取的RNA經DNA酶消化后，取2L進行電泳檢測，再采用Promega公司的GoScript? Reverse Transcription System試劑盒，取4g已純化的總RNA進行反轉錄，反應體系為20L。

1.6 表達分析

采用美國BIO-RAD公司iTaq Universl SYBR Green supermix反應試劑對9個進行實時熒光定量PCR (qPCR)分析。使用Primer Premier 5.0軟件在基因特異性區域設計引物(表1)，以鐵皮石斛為內參基因(NCBI accession No.: JX294908), 于ABI 7500 Real-time PCR儀上進行qPCR，并使用其系統軟件對數據進行處理, 采用2?ΔΔCT方法[27]計算相對表達量。鐵皮石斛花的發育分為3個時期：小花蕾期(約0.5 cm)、中花蕾期(約1 cm)和全開期。采用qPCR對在花不同發育階段和不同組織的表達模式進行分析。用百邁客云平臺(http://www. biocloud.net/)在線軟件繪制熱圖(heatmap)。

表1 實時熒光定量PCR所用引物

2 結果和分析

2.1 WOX轉錄因子的鑒定和進化樹構建

在NCBI基因組數據庫下載鐵皮石斛基因組文件，并利用Pfam、Swiss_Prot、eggNOG_class、NR注釋結果檢索WOX轉錄因子，共鑒定出9個鐵皮石斛WOX家族基因成員，分別命名為、、、、、、、和。

以鐵皮石斛WOX家族蛋白和擬南芥WOX家族蛋白構建進化樹(圖1)，結果表明, 鐵皮石斛的WOX家族可分成3個進化支，分別為WUS、Ancient和Intermediate，其中WUS的成員數量最多，分別是DoWOX3、DoWOX4、DoWOX5、DoWOX6和DoWOX9；其次是Intermediate，分別是DoWOX1、DoWOX2和DoWOX7；Ancient的數量最少，僅有DoWOX8。此外，WUS支的DoWOX4和DoWOX5的分支長度差比其他DoWOXs間的分支長度差短、置信度最高，說明DoWOX4和DoWOX5親緣關系最近、同源性最高，暗示他們具有相似的功能。

2.2 DoWOXs的生物信息學分析

使用DNAMAN的默認參數對9個DoWOXs進行多重序列比對，結果表明，鐵皮石斛WOX家族成員均含有保守的同源異型結構域(homeobox domain, HD)，具有“螺旋-環-螺旋-轉角-螺旋”的結構特征(圖2)。此外，在螺旋I和螺旋III中存在許多高度保守的位點，暗示這些氨基酸殘基可能在基因功能上發揮重要的作用。

利用MEME工具對鐵皮石斛WOX家族成員的蛋白結構進行分析(圖3), 結果表明，所有DoWOXs都含有串聯的Motif1和Motif2，說明其在WOX家族成員中較為保守。在Intermediate成員中存在Motif3的保守基序；WUS家族成員中除DoWOX9外，其余成員在C端都有保守的Motif4；Ancient成員DoWOX8含有的保守基序最少，說明WOX可能具有復雜的進化過程。此外，同一亞家族中的DoWOX4和DoWOX5的保守基序都是5個，且位置相近，表現了很強的一致性，說明DoWOX4和DoWOX5具有相似的蛋白質功能和結構，同時從側面反映了系統進化樹分析的可靠性。

圖1 鐵皮石斛(Do)和擬南芥(At)的WOX家族成員構建的系統進化樹

圖2 鐵皮石斛WOX家族成員氨基酸序列的多重比對

2.3 DoWOXs基因結構

利用在線軟件GSDS構建鐵皮石斛基因的內含子-外顯子結構圖(圖4)，可見，大部分有內含子1～3個，外顯子1～3個。結合系統進化樹，不同進化分支的基因結構差異明顯, 即使是相同分支的基因間也存在一定差異，但同源性最高的和的基因結構極其相似。此外，同為WUS支的，其基因結構與和相似，皆為2個外顯子，1個內含子，說明WUS支的基因結構較為保守。Ancient支中的有3個外顯子和2個內含子。

圖3 DoWOXs蛋白的保守基序

對的啟動子用PlantCARE進行分析(圖5)，結果表明，9個共含有13個與生長發育相關的順式作用元件，不同基因間的順式作用元件不同。其中，順式作用元件meristem expre- ssion共有6個，含有3個，說明其可能在鐵皮石斛分生組織的生長上扮演重要角色。與激素相關的順式作用元件有auxin-responsive、gibbe- rellin-responsive、MeJA-responsive、abscisic acid responsive、salicylic acid responsive等，在植物和環境脅迫的適應中扮演重要角色；與逆境脅迫相關的非生物激素的順式作用元件有drought-inducibility、defense and stress responsive、low-temperature responsive和anaerobic induction等，間接影響生長發育。這說明WOX家族成員在鐵皮石斛生長發育過程中，參與胚胎發育、種子萌發、分生組織生長、根系發育和環境脅迫的調控等活動。

2.4 DoWOXs的表達

鐵皮石斛類原球莖被認為是體胚[28]，可增殖, 亦可分化成完整的植株，而WOX成員在維持植物的干細胞狀態中起著重要的作用。采用qPCR技術分析了在鐵皮石斛不同發育階段中的表達模式(圖6)，結果表明，除外其余在類原球莖、叢生芽和小苗中有表達。、、、和在類原球莖中的表達量最高，表明WOX在鐵皮石斛的類原球莖發育中扮演重要角色。在叢生芽中的表達量最高，在小苗中最高,和在3個不同發育時期表達量均較高。此外，不同發育時期優勢表達的不同，如在類原球莖特異表達，可能與其具有不同的啟動子順式作用元件有關。

圖4 DoWOXs基因結構

圖5 DoWOXs啟動子中的順式作用元件

圖6 DoWOXs基因在鐵皮石斛不同發育時期的表達

開花是植物發育中非常重要的階段，WOX參與植物花發育過程[18]。利用本實驗室建立的鐵皮石斛花發育數據庫，獲取了在小花蕾(S1)、中花蕾(S2)和全開花(S3)中的表達數據，利用百邁客云平臺在線軟件繪制熱圖(圖7)，可見，、的表達模式較為相似，在S1時期的表達量最高，其次為S2時期，S3時期最低，暗示這2個基因在花發育過程中功能相似。在3個時期的FPKM值均大于20，S2時期的表達量最高，而其他在3個時期的FPKM均小于5。

圖7 DoWOXs在鐵皮石斛不同開花期的表達譜。S1: 小花蕾; S2: 中花蕾; S3: 全開花; 紅色: 上調; 綠色: 下調。

蘭科植物的花具有較高的觀賞價值主要源于其獨特的花型，有3個瓣化的萼片，2個花瓣，1個唇瓣和1個合蕊柱[29]。進一步選取S2時期的花蕾進行不同組織的表達分析，結果表明(圖8),和在花蕾的4個組織中均未表達；僅在唇瓣和合蕊柱中表達；其余6個在中花蕾的不同組織中均有表達，其中在唇瓣中表達較高，在萼片中表達最高，在花瓣中表達最高，和在合蕊柱中表達最高。這暗示家族成員在鐵皮石斛花生長發育過程中具有不同的調控作用。此外,和在合蕊柱的表達量遠高于其他花器官，可能與花形態發育密切相關。

3 結論和討論

參與調控植物發育的基因在形態建成中起著關鍵的作用。WOX轉錄因子是參與植物發育的重要家族之一。本研究從鐵皮石斛全基因組中鑒定出9個WOX轉錄因子(DoWOX1～DoWOX9)，生物信息學和表達分析表明，WOX轉錄因子在鐵皮石斛的生長發育尤其是類原球莖和花發育中起重要的調控作用。和在開花時期表達量的變化規律一致，且DoWOX4和DoWOX5氨基酸序列相似度高(圖1)，暗示這2個轉錄因子可能在調控花發育過程中的功能相似。此外，DoWOX4、DoWOX5和AtWOX3在系統進化樹上的親緣關系最近，AtWOX3在擬南芥花發育尤其是花表型構成中起作用[18]。

9個編碼蛋白的同源異型結構域(HD)保守性高，具有典型的“螺旋-環-螺旋-轉角-螺旋”結構，這與其他物種[30-31]的研究結果一致，表明該同源異型結構域在進化上具有較高的保守性。該同源異型結構域可以特異地和DNA序列結合而發揮重要的作用[32]，如作為HOX蛋白的輔助因子影響植物、動物和真菌的發育[8]。基因結構分析表明, WUS支的成員基因結構較為保守。不同支系DoWOXs蛋白的保守基序在數量、位置上具有較高的相似性，這與系統進化樹的結果一致。此外，Motif1和Motif2基序的保守程度更高。

基因的表達調控是一個復雜的過程，轉錄因子通過結合基因的順式作用元件來調控基因的表達。的啟動子上含有響應植物激素和逆境脅迫等相關的順式作用元件，生長素可調控胚胎發育[33]、脫落酸影響種子休眠和萌發[34]，茉莉酸甲酯(MeJA)參與植物防御反應[35]，因此，可能參與植物生長發育和防御反應。

類原球莖、芽和小苗是鐵皮石斛3個典型的生長發育階段。5個在類原球莖中高表達, 說明在調控鐵皮石斛類原球莖發育具有重要的作用，這與梁易等[24]的研究結果一致。類原球莖發育是鐵皮石斛的特有階段。在類原球莖中表達量最高，在芽和小苗中不表達，與同源性最高的的表達模式相似[36]。有大量研究表明，在植物的胚胎發育中扮演不同的角色，如

和影響擬南芥的胚胎模式[12]，調控云杉()的體細胞胚胎發生[37]。在芽中表達最高，可能與鐵皮石斛芽發育有關。參與調控植物芽的發育，如在擬南芥芽再生發育過程是必需的[38]、通過招募相關蛋白影響水稻芽的發育[39]。除外，其余在小苗中均有表達，說明可能調控鐵皮石斛小苗發育。花發育是植物生殖階段的重要過程，在小花蕾、中花蕾和全開花時期都有表達，說明在鐵皮石斛花發育中起著重要的調控作用。調控花發育的作用在擬南芥、矮牽牛和煙草等植物中已有報道[17-20]。除和外，其余均在中花蕾不同組織中表達，說明在中花蕾時期和可能和其他存在功能冗余的情況，具體功能還需進一步研究。合蕊柱是蘭科植物花的獨特結構，和在合蕊柱中的表達量遠遠高于其他組織，推測兩者調控鐵皮石斛花的發育，但具體功能有待進一步研究。同一亞家族成員存在一些相似的功能，有研究表明WUS分支的其他成員存在不同程度替代WUS在芽和花干細胞維持方面的功能[16]，這為尋找WOX家族的共性提供一個突破口。

植物組織培養技術是目前解決鐵皮石斛種苗較難繁殖的主要方式，干細胞的形成與分化是組織培養中的重要環節，因此，研究鐵皮石斛干細胞的相關分子機理具有十分重要的意義。蘭科植物的花是重要的生殖器官，而且具有較高的觀賞價值，研究蘭科植物花器官發育對了解其花形成機制及品種選育提供了重要的理論基礎。本研究為進一步挖掘鐵皮石斛WOX轉錄因子功能奠定了基礎。

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Identification and Analysis of WOX Transcription Factor in

ZENG Dan-qi1,2, ZHANG Ming-ze1, HE Chun-mei1, WANG Hao-bin1,2, YU Zhen-ming1, SI Can1,2, ZHAO Cong-hui1,2, LI Dong-mei3, DUAN Jun1*

(1. Guangdong Provincial Key Laboratory of Applied Botany, Key Laboratory of South China Agricultural Plant Molecular Analysis and Gene Improvement, South China Botanical Garden, Chinese Academy of Sciences,Guangzhou 510650, China; 2. University of Chinese Academy of Sciences,Beijing 100049, China; 3. Shunde Polytechnic,Foshan 528300, Guangdong, China)

In order to understand the function of transcription factor WOX in, the WOX family members inwere identified by whole genome analysis techniques, the bioinformatics of WOXs and expression patterns ofwere analyzed. The results showed that there were ninetranscription factors ingenome, named DoWOX 1to DoWOX 9, respectively. The most ofcontained 2-3 exons, whilehad only one exon. The promoters ofcontained-regulatory elements related to hormone induction, stress responsive, plant growth and development. The expression of,,,andwere the highest at protocorm-like body (PLB) stage by qPCR, which ofwas the highest at small flower bud stage, and then decreased. In addition, the expressions of,andwere the highest in columns, and that ofwas the highest in lips. Therefore,might be involved in regulating the growth and development of,and play an important role in maintenance of PLBs state and flower development.

; WOX transcription factor; Bioinformatics analysis; Gene expression; qPCR

10.11926/jtsb.4294

2020-08-18

2020-09-23

中國科學院華南農業植物分子分析與遺傳改良重點實驗室開放課題(KF202008)；廣州市科技計劃項目(201707010345)資助

This work was supported by the Open Project of Key Laboratory of South China Agricultural Plant Molecular Analysis and Genetic Improvement, South China Botanical Garden, Chinese Academy of Sciences (Grant No. KF202008); and the Project for Science and Technology Planning in Guangzhou (Grant No. 201707010345).

曾丹琦(1997～ )，女，碩士研究生，從事鐵皮石斛生物技術育種研究。E-mail: ZengDanqi20@scbg.ac.cn

Corresponding author. E-mail: duanj@scib.ac.cn