合成生物學在農殘檢測領域的應用

毛金竹，肖淑玲，楊智淳，王孝宇，張詩，陳俊宏，謝佶晟，陳福德，黃子諾，馮天宇，張璦琿，6，方柏山，6，7

（1廈門大學遺傳工程機器設計創新實踐平臺，福建廈門361005；2廈門大學化學化工學院，福建廈門361005；3廈門大學藥學院，福建廈門361005；4廈門大學材料學院，福建廈門361005；5廈門大學公共衛生學院，福建廈門361005；6廈門市合成生物技術重點實驗室，福建廈門361005；7福建省化學生物學重點實驗室，福建廈門361005）

引 言

二十世紀中葉以來，隨著化學品生產工藝的革新，廉價高效的農藥逐漸成為現代農業生產中的“必需品”。圖1（a）表明，世界每公頃耕地面積的農藥使用量（kg/ha）從1990年至2017年增長了70%[1]。在全球范圍內，每年農藥的使用量接近30億千克，商品估值約為400億美元[2]，這些數據表明農藥的市場十分龐大并不斷擴張。

雖然農藥的使用有效地避免了農作物的病蟲害，提高了產量，但隨著農藥的使用范圍不斷擴大，其對于環境的污染和動植物的危害也顯露出來，直接威脅著人類的健康[圖1（b）]。化學合成農藥是應用最廣泛、毒副作用最顯著的一類農藥，包括有機磷類、有機氯類、擬除蟲菊酯和氨基甲酸酯類等[2]。這類農藥化學性質穩定、半衰期長并且能夠在自然界長期存在并蓄積[3]，從而引起環境污染。據研究報道，在地下水、地表水[4]、土壤[5]、空氣[6]和高海拔地區[7]都能檢測到這類農藥。化學合成農藥還表現出廣泛的毒性，有機磷農藥和有機氯農藥具有強的神經、消化、內分泌、生殖系統等[8-15]毒性。擬除蟲菊酯和氨基甲酸酯類殺蟲劑雖然毒性較小，但也被報道能夠增加多種疾病的患病風險[16-18]。農藥殘留對人類的健康造成了極大的威脅，對其進行有效檢測成為保障人類健康安全的重要環節。但常規的檢測手段操作復雜、等待時間長、檢測成本昂貴[19]，無法滿足農殘原位檢測的需要。因此開發靈敏度高、特異性好、耐用性強的便攜快速檢測方法對微量甚至是痕量的農殘進行有效監控已成為農藥檢測研究領域的熱點及難點之一。

合成生物學作為一門新興科學，通過基因編輯手段和工程化思維對生物體進行改造與創新，常被稱作變革性的工具。其獨特的創造性近幾十年來給多個領域和行業帶來了新的生機與活力。以環境修復領域為例，利用合成生物學改造出的菌株能夠有效檢測和降解多種環境污染物[20-22]，其中包括對農藥殘留的檢測。合成生物學能夠將傳統的生物傳感器、農殘誘導操縱子等響應部件和輸出不同信號的報告系統進行多樣化組合，激發傳統生物檢測技術的新潛能，為多種農殘的檢測提供新的思路與方法。原位檢測農殘的特點更是傳統檢測手段無法比擬的，高靈敏度和多輸出信號也打破了農殘檢測的固有局限，拓寬了檢測的應用范圍。對比傳統的檢測手段，本文歸納與總結當前合成生物學技術在農殘檢測領域的應用與創新，分析其具有的優勢與挑戰。

1 傳統檢測方法

圖1 世界農藥使用量情況及其危害[1]Fig.1 World pesticide use and itshazards[1]

目前檢測農藥殘留的傳統方法大致可分為兩類：一類是以色譜法、質譜法、光譜法以及酶聯免疫吸附（ELISA）等方法為代表的常規方法，這些方法能夠提供可靠的分析結果，但操作費時、預處理復雜、成本昂貴且需要使用大量的有機溶劑，因此不適用于針對大量樣品的檢測工作[23]；另一類則是基于各種生物傳感器的先進檢測方法，操作簡單、檢測成本低且適合現場檢測，但高昂的開發成本限制了其在現階段的應用。

1.1 傳統的波譜檢測技術

1.1.1 氣相色譜法 氣相色譜（GC）適用于分析非極性、易揮發且易氣化的化合物。其通常與特定的檢測器結合用于不同農藥檢測，表現出了優異的性能[24]，如電子捕獲檢測器（ECD）適用于檢測鹵代化合物，火焰光度檢測器（FPD）主要用于測定含硫和磷的農藥化合物，氮磷檢測器（NPD）對含有氮和磷的農藥有極高的選擇性，而火焰離子化檢測器（FID）則幾乎適用于各種農藥的檢測[25]。

1.1.2 液相色譜法 液相色譜（LC）可以用于檢測強極性、揮發性弱及對熱敏感的化合物，一般與熒光檢測器、紫外檢測器等檢測裝置聯用。其中高效液相色譜法被廣泛應用于農殘檢測[26]。

1.1.3 質譜法 質譜法（MS）常與GC、LC聯用。GC-MS檢測器擁有更強的靈敏度、準確性、結果重現性以及抗干擾性。此外，使用GC-MS能夠進一步提高檢測方法靈敏度與抗干擾能力[25]。LC-MS極大地提高了檢測結果的準確性與選擇性，且能夠同時完成不同農藥成分的識別與確認。由于其無須衍生化、高靈敏度等特點，近年來已經成為多組分農殘分析中的首選方法[26]。

1.2 酶聯免疫吸附法

酶聯免疫吸附（ELISA）法因其低成本、操作簡單等優點而被格外重視。該方法基于抗原-抗體間的特異性相互作用，因此能為某些農藥提供特異性極高的檢測結果。同時，該方法能夠一次性裝載大量樣品，極大地簡化了樣品的處理程序[27]。

單鏈抗體（scFvs）和納米抗體（VHHs）等小抗體與特定蛋白進行融合產生的新型酶聯免疫吸附方法也開始出現[28-29]，常見的設計為抗體-堿性磷酸酯酶（AP）融合體。如圖2所示，這種融合表達設計能夠省去二抗的步驟，是一種簡單快速的競爭性酶聯免疫吸附測定方法。該法已被應用于擬除蟲菊酯類農藥[28,30-31]、有機磷類農藥[32-34]的檢測。但該技術特異性較差，對于特定農藥檢測的專一性不夠強，無法勝任未知樣品的農殘檢測[35]。

1.3 毛細管電泳法

毛細管電泳法（CE）對樣品量要求較低、分離效率高且耗時短。但毛細管內徑較小，在檢測中只允許少量進樣，因此在靈敏度方面有一定的欠缺，一般與高靈敏度的檢測方法（如MS）聯用以彌補不足[36]，或者通過更高效的樣品濃縮方法來提高檢測的靈敏度[37]。該方法與色譜法及ELISA相比，進一步提高了檢測效率并降低了成本。

1.4 表面增強拉曼光譜法

表面增強拉曼光譜（SERS）法具有快速測定食品中農藥殘留的能力，其靈敏度極高且操作方便。目前已經開發出多種SERS檢測方法：原位SERS方法，可直接檢測植物表面的農藥殘留[38-39]；以納米銀粒子為基質的SERS方法無須樣品處理即可檢測飲料樣品[40]；結合表面拭子的SERS方法可對水果表面殘留的農藥進行檢測[41]。但使用該方法需建立不同農藥分子的光譜數據庫，并對農藥的代謝物、轉化產物等進行光譜學的研究。

圖2 利用scFv-AP進行競爭性酶聯免疫吸附測定（ELISA）[32]Fig.2 The competitive enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)was performed using scFv-AP[32]

1.5 傳統的無細胞生物傳感器法

傳統的無細胞生物傳感器基于配體-受體特異性結合的原理，將待檢測物的含量、種類等信息通過不同的方法轉化為各種信號，從而達到定量檢測的目的[42-47]。這類方法與前述的方法相比集成度高、簡單便攜且不依賴于精密儀器。

1.5.1 電化學生物傳感器 電化學傳感器依靠不同的酶與特定農藥結合后釋放的電信號完成對農藥的識別與定量，一般將酶純化后固定于電極進行檢測。酶及電極材料的選擇對傳感器特性影響顯著。傳統的乙酰膽堿酶（AChE）傳感器檢測番茄中的農藥，常見農藥檢出限約為2μmol/L[42]。而使用Fe3O4/羧基化多壁碳納米管修飾過的金電極作為負載材料時，針對某些常見農藥的檢出限可低至0.1 nmol/L[43]。但這種方法的局限在于酶的純化成本較高，操作也十分復雜。與全細胞生物傳感器相比，重復使用性能不足。

1.5.2 壓電生物傳感器 將能與待測物特異性結合的蛋白負載在具有壓電效應的材料上，待測物存在時，其與蛋白之間的吸附作用會導致蛋白質量發生變化，這種變化會轉化為電信號，放大后實現農殘定量檢測。二氧化硅作為傳統的壓電材料，在早期常作為承載物使用[44]。近些年隨著材料技術的發展，選用聚合物材料作為承載物開始逐漸成為一種趨勢[45]。

1.5.3 熒光探針生物傳感器 通過設計熒光探針測定酶活，進而檢測農殘的方法在氨基甲酸酯類和有機磷類農殘檢測中都有廣泛的應用。有機磷和氨基甲酸酯能夠抑制乙酰膽堿酯酶的催化作用，利用這一特性開發了基于乙酰膽堿酯酶（AChE）催化的高靈敏度熒光生物傳感器[46-47]，其作用原理見圖3。

傳統的生物傳感器主要以無細胞傳感器為主，利用純化蛋白結合負載材料或設計探針的方法實現農殘的檢測。與之不同的是，合成生物學傳感器則在細胞內構建響應農殘分子的模塊化基因回路，農殘分子或其降解產物在胞內特異性的結合啟動了響應模塊的表達，以此實現農殘分子快速和高靈敏的檢測。綜上所述，現行的一些傳統農殘檢測方法仍存在成本高、操作復雜等局限性，尋求能夠突破這種局限的創新方法成為當前研究的主要目標，合成生物學的出現為實現這個目標創造了可能。

2 應用于農殘檢測的合成生物學

近年來合成生物學模塊化、工程化思想逐漸應用于農殘檢測領域，本節將結合目前合成生物學在農殘檢測領域的應用（表1），對其應用原理進行介紹。

2.1 全細胞生物傳感器

合成生物學技術可以在細菌體內構建模塊化基因回路并建立起能夠檢測特定類型農藥的全細胞生物傳感器。生物傳感器的構建不再需要純化蛋白的復雜步驟，而是將整個細胞作為檢測器，大大節省了時間和成本。

2.1.1 表面展示水解酶 當前研究已報道了多種能夠降解特定農殘的酶，如有機磷水解酶（OPH）[60]、甲基對硫磷水解酶（MPH）[61-62]、γ-六氯環己烷脫氫氯酶[48]等。這些酶能夠將農殘降解為更易于檢測的

圖3 基于AChE的高靈敏度熒光生物傳感器[46]Fig.3 High sensitivity fluorescent biosensor based on AChE[46]

表1 合成生物學在農殘檢測中的應用Table 1 Application of synthetic biology in pesticide residue detection

小分子或特征化合物，通過檢測降解產物可以間接測定農殘含量。這些酶的發現及其基因鑒定是合成生物學的改造基礎。農殘降解酶通常存在于土壤微生物體內，但這些微生物往往繁殖能力弱、對生長環境要求高、產酶效率低，不適合作為全細胞生物傳感器的底盤細胞。合成生物學技術將原始宿主菌體內的降解途徑轉移到易于進行基因操作的細菌體內，成功構建出高效的農殘檢測工程菌株[48]。同時為了避免農藥低效的跨膜轉運及轉運的損失，常通過表面展示系統將降解酶表達在菌體表面，利用體外催化的方式實現對農殘的降解與檢測[53-54,63]。除催化型的生物傳感器外，近些年利用重組基因技術在菌體表面展示抗體的農殘檢測方法也開始出現[58]。

2.1.2 轉錄激活反應 操縱子系統對農殘進行特異性響應也是合成生物學在農殘檢測領域的一種重要應用。轉錄調節因子可以結合特定的農藥化合物，進而作用于相應的啟動子，開啟其轉錄過程。其作用原理如圖4所示：將各種類型的報告基因插入到啟動子的下游，若試樣中有農殘存在，則會激活啟動子，啟動報告基因的表達，通過檢測輸出信號測定農殘含量。操縱子與報告基因多樣化組合的特點，使得不同強度甚至響應不同農藥的基因元件可以組合使用，并且能夠進行靈活多變的調節，應用范圍十分廣泛，如AtzR[49]、DmpR等[64]。

圖4 農藥分子特異性激活轉錄調節因子Fig.4 Pesticide specific activation of transcription regulators

多種農藥及其降解產物具有干擾細胞內分泌的功能，表現為雌激素樣作用或抗雌激素樣作用，因而可以通過內分泌干擾物篩選試驗進行農殘檢測[65]。利用這一特性已開發了酵母轉錄激活基因（GAL4）雙元系統等一系列的農殘檢測方法[66]。GAL4雙元系統法中兩種質粒：表達雌激素受體配體結合域（ERdef）和Gal4融合蛋白的pGal4-ERdef質粒與Gal4反應性熒光素酶報告質粒pUAS-tk-Luc共轉化，其中Gal4能夠顯著誘導UAS下游基因的表達。通過測試樣品是否誘導/拮抗Luc（熒光素酶）表達，來判斷試樣中是否存在農殘。合成生物學方法使用報告基因顯示樣品的內分泌干擾作用使得農殘檢測更加直觀和方便，增加可視性的同時也大大降低了農殘檢測的難度。

2.2 無細胞合成生物學

無細胞合成生物學指的是構造的工程化回路在無細胞底盤的類細胞系統中（含有細胞表達的必需成分）進行轉錄與表達[67]，其能精準控制各組分的混合比例，與簡單的數學建模相結合，檢測更加準確。無細胞合成生物學的出現，規避了基因修飾微生物（genetically modified organisms,GMOs）的釋放，避免了生物安全性問題[68]，使得合成生物學應用于農殘的現場檢測更為安全，更具實用性。同時無細胞合成生物學方法對于檢測環境的要求更為寬松，能夠在高毒性環境下工作，適應多種農殘檢測的需要。該系統還能避免農藥進入細胞轉運效率低、重組菌發生基因突變等問題。目前使用熒光素酶作為報告基因的無細胞生物傳感器已成功用于轉錄誘導物的檢測研究[69]，但無細胞合成生物學的研究還十分稀缺，主要原因是目前對天然的體內遺傳學的研究仍不透徹，其開發與應用具有極大的挑戰性。高成本、技術難度大、實施困難等弊端嚴重地限制了其開發與規模化應用[67]，隨著技術的不斷創新，相信未來的農殘檢測領域將會涌現出一系列優秀的無細胞合成生物學檢測方法。

從本節的敘述中可以發現，合成生物學技術在農殘檢測中的應用原理十分多元化，足以表明合成生物學在此領域具有巨大的研發價值與應用潛力。

3 合成生物學在農殘檢測中的應用

3.1 合成生物學應用于有機氯農藥的檢測

有機氯農藥（OCs）是一類半衰期長的有機化合物，常見的有機氯農藥有二氯二苯基三氯乙烷（DDT）、林丹（γ-HCH)、阿特拉津、β-六氯環己烷（β-HCH）等。由于使用廣泛和半衰期較長，OCs已成為環境中普遍存在的污染物[70]。

對于有機氯農藥，目前的主要檢測方法是氣相色譜-質譜法、固相萃取色譜法等復雜精細的方法，這些方法費時又昂貴，不適于現場檢測。近些年來針對此類農藥，已經開發出一些極具潛力的合成生物學檢測方法。

3.1.1 代謝礦化作用 檢測有機氯農藥的主要思路是將難以直接檢測的有機物初步代謝為易于檢測的化合物。研究表明γ-六氯環己烷氯化氫酶通過三步脫氯作用，可初步降解林丹（γ-HCH），并釋放三個HCl分子。聚苯胺的質子化程度及其電導率隨pH的降低而增加，將HCH脫氯化氫酶（LinA2）基因導入大腸桿菌中表達，并將工程菌固定在可檢測pH變化的聚苯胺基質中，施加0.4 V電勢時，電流可隨pH的降低（HCl分子的產生）而增加，因而構建出高靈敏度、選擇性強的林丹（γ-HCH）全細胞傳感器[48]。

而在Gong等[71]的研究中，在底盤生物惡臭假單胞菌KT2440中組裝了來自三種不同微生物的七種酶，將γ-HCH完全礦化為CO2和H2O。盡管尚未有基于此的檢測研究成果報道，但是若能設計出響應這一過程分解產物的生物元件，便能開發出全新的農藥檢測傳感器。

3.1.2 激活轉錄調節因子法 Hua等[49]利用轉錄調節因子AtzR與阿特拉津降解產物氰尿酸的特異性結合能夠作用于atzD啟動子輸出信號的特點來實現對阿特拉津的檢測。在此研究中，atzD啟動子及其調節轉錄因子AtzR與氰尿酸作用，讓氰尿酸檢測從pH檢測、電流檢測等中脫離出來，以lux CDABE基因實現生物發光報告氰尿酸的濃度，直接明了且易于操作。

3.2 合成生物學應用于有機磷農藥的檢測

有機磷農藥（OPs）是磷酸及其衍生物的酯類化合物，其主要的作用機制是抑制乙酰膽堿酯酶（AChE）的活性[11]。由于有機磷農藥具有多種毒性，其一直是農殘檢測的重點對象。

目前針對有機磷農藥的合成生物學檢測手段主要分為兩大類：一類是基于有機磷水解酶（OPH）、甲基對硫磷水解酶（MPH）等催化型的生物傳感器；另一類是基于乙酰膽堿酯酶（AChE）抑制型的生物傳感器[50,72]。考慮到純化酶成本和有機磷轉運入胞效率等問題[28-29,73]，目前的研究通常在菌體表面展示相關酶，常用的表面展示系統包括Lpp-OmpA[22,50,73]、INPNC[22,53-54,63]等。

3.2.1 表面展示有機磷水解酶（OPH）有機磷水解酶（OPH）是一種能夠水解多種有機磷農藥的酶[60]，由opd基因編碼。其水解產物多樣化，可與多種感應系統搭配使用，應用價值高。

（1）pH檢測法 目前已在大腸桿菌、酵母菌等菌體內成功表達OPH，催化有機磷生成質子。其與表面展示系統聯用，可通過測定菌體周圍的pH，建立有機磷濃度與pH之間的定量關系，從而實現直接、快速、便捷檢測有機磷的目的[21,50]。檢測裝置如圖5所示，將工程細胞懸液滴入聚碳酸酯膜中心，并將細胞固定膜連接到pH電極的氫離子傳感玻璃表面，將溶解在純甲醇中的有機磷神經毒劑（5～10μl）添加到電池中（過程在恒溫的緩沖液中進行），用pH/離子分析儀記錄電勢（即pH）的變化最后傳輸到記錄器，這種檢測方法已被證實可在2個月內保持良好的穩定性，檢測限可低至2μmol/L[50]。

此外利用綠色熒光蛋白（GFP/EGFP）的熒光值能對pH變化做出快速響應的特點也可實現檢測。如圖6所示，將水解酶與熒光蛋白融合[22]或共同表面展示[51,60]，通過熒光顯微鏡測定全細胞熒光強度實現有機磷農藥濃度的檢測，檢測十分快速，較電極法操作更簡便。

雖然pH檢測法簡便快速，但其對有機磷農藥的特異性不強，易受到多種因素的干擾，對于一些較為復雜的檢測情況，其實用性仍存在一定的問題。

（2）對硝基苯酚（PNP）響應法 OPH降解對硝基苯基取代的有機磷農藥的產物之一是對硝基苯酚（PNP），因而對對氧磷、對硫磷、甲基對硫磷等有機磷農藥進行檢測的另一種思路是檢測PNP的濃度。

通過合成生物學構造表面展示OPH的重組大腸桿菌細胞降解產生PNP，從而開發出的光纖生物感應器就是其中一個成功的案例[52]。該系統適用于多種有機磷的檢測，具有較強的選擇性。此外，直接利用分光光度計在410 nm處檢測PNP也顯示出較寬的檢測范圍和較強的特異性，還具有比光纖檢測系統更加優良的靈敏度[53]。

而間接響應PNP需要借助能夠降解PNP的惡臭 假 單 胞 菌JS444（Pseudomonas putidaJS444）[74]。通過基因改造在惡臭假單胞菌JS444表面展示OPH，使其能夠同時降解有機磷（OPs）和PNP。一系列的酶促反應會消耗氧氣，故將其與溶解氧電極搭配能建立有機磷農藥含量與電流之間的定量關系，從而實現對硝基苯基取代的有機磷農藥的檢測[54,75]。與前文pH檢測法相類似，將工程菌固定在氧電極上，向電池中添加10～20μl已知濃度的有機磷農藥溶液，使用數字生物氧監測儀進行監測，最后傳輸數據至圖表記錄器，5 min后測量氧電極的穩態輸出。出色的靈敏度、穩定性和便攜易操作的優勢都使其成為合成生物學在農殘檢測中應用的經典案例。此外，惡臭假單胞菌JS444還可被另一種能夠降解PNP的莫拉氏菌屬（Moraxellasp.）代替[76]，可起到同樣的效果[55,77]。

3.2.2 激活轉錄調節因子法 已發現了對氧磷誘導型啟動子[78]及能夠被毒死蜱（CPF）敏感型轉錄調節因子（ChpR）開啟的啟動子ChpA[56]，若在它們下游安插報告基因，可通過對報告信號的監測來實現檢測。此外，還存在多種能夠被對硝基苯酚（PNP）激活的轉錄調節因子，并已應用于有機磷的檢測，如PnpR[57]、DmpR[64]。OPH催化產生的PNP激活轉錄因子，被激活的轉錄因子與同源啟動子結合（如PnpR-PnpC，DmpR-Pdmp），可開啟下游報告基因的表達，通過比色法或其他檢測技術就可簡單、快速地對有機磷農藥進行檢測。該法能夠與多種報告基因組合，可根據不同的檢測需要進行方案調整，充分體現了合成生物學的優勢。

圖5 pH玻璃電極檢測有機磷[50]Fig.5 Detection of organophosphorus by pH glass electrode[50]

圖6 表面展示水解酶及綠色熒光蛋白[22,51]Fig.6 Surface display of hydrolase and green fluorescent protein[22,51]

3.3 合成生物學應用于擬除蟲菊酯類農藥的檢測

擬除蟲菊酯類農藥對多種害蟲具有殺傷作用，毒性相對較小，一直被廣泛使用，但長期接觸仍會對哺乳動物帶來內分泌干擾、免疫毒性等多種不良反應。因此農副產品和食品中擬除蟲菊酯的殘留問題也不容忽視[79]。

3.3.1 基于重組基因技術的免疫檢測 近些年免疫檢測技術迅速發展，已經有研究者設計了高效的針對擬除蟲菊酯的免疫測定法[80]。擬除蟲菊酯在人類體內會較快代謝為3-苯氧基苯甲酸（3-PBA），因此3-PBA是一種用于監測人類接觸擬除蟲菊酯殺蟲劑的生物標志物[28,58]。Riangrungroj等[58]研究出了一種響應3-PBA的全細胞生物傳感器。其使用合成生物學技術在大腸桿菌表面展示抗3-PBA VHH。當工程細胞與加入的牛血清白蛋白偶聯的3-PBA半抗原（3-PBA-hapten-BSA）結合時，可以直觀地觀察到細胞粘連。若樣品中存在游離的3-PBA，其與3-PBA-hapten-BSA競爭結合VHH，破壞細胞粘連并使之沉淀。同時通過共表達紫藍色amilCP色素蛋白使細胞著色，提高了檢測性能，檢測限可低至3 ng/ml。

3.3.2 轉錄激活試驗 借助擬除蟲菊酯類農藥的雌激素樣作用[81]及其降解產物3-PBA的抗雌激素活性開發出了一種雌激素受體（hERα/rERα）介導的熒光素酶報告法[66]。利用雌激素結合域（ERdef）和GAL4的融合蛋白及GAL4反應性熒光素酶報告質粒pUAS-tk-Luc，測試樣品是否誘導Luc（熒光素酶）表達或拮抗Luc表達，來判斷試樣中是否存在擬除蟲菊酯類農藥。此外，將雌激素受體（ER）替換成雄激素受體（AR），也顯現出類似的作用原理[82-83]。但由于自然界有多種能夠影響雌激素作用的物質，故該方法不適合用于針對未知樣品的檢測。同時擬除蟲菊酯類的農藥雌激素樣作用相對較弱，甚至在有些研究中未呈現雌激素樣作用[84]，這直接導致檢測靈敏度不佳[66]。

表2 合成生物學方法檢測農殘的優缺點Table 2 Advantages and disadvantages of synthetic biological methods for pesticide residues detection

3.4 合成生物學應用于氨基甲酸酯類農藥的檢測

氨基甲酸酯類農藥在自然環境下的持久度低且殺蟲效果好，因而成為近年來應用較為廣泛的殺蟲劑[85]。氨基甲酸酯會不可逆地抑制中樞和外周神經乙酰膽堿酯酶的活性，導致乙酰膽堿在人體內大量聚集，嚴重可致命[86]。

我國現行氨基甲酸酯類農藥國家標準檢測方法有色譜法、膽堿酯酶抑制法等。色譜法儀器體積大、操作要求較為嚴格。因此建立靈敏、簡便的檢測方法是很必要的[59]。無細胞生物熒光傳感器就是一種可行的方法，張昊等[59]從氨基甲酸酯類農藥降解菌H5的基因文庫中篩選出能對氨基甲酸酯特異性響應的啟動子基因，在其下游連接熒光蛋白（EGFP）基因構建重組質粒，后通過溶菌酶凍融破碎技術制備出能高效檢測氨基甲酸酯類農藥的無細胞體系生物熒光傳感器。

雖然現階段合成生物學在氨基甲酸酯類農殘檢測中的應用較少，但是一系列氨基甲酸酯類化合物的水解酶的發現及其在大腸桿菌中的成功表達[87]，展現了這一領域的潛力，相信在未來合成生物學將會在氨基甲酸酯類農殘檢測中有更大的貢獻。

4結 語

合成生物學作為一門新興學科，在短短十多年間已經取得了眾多突破性的進展。目前研究者們已經構建了大量在實驗室范圍內可用的全細胞生物傳感器，也開發了一些更具實際應用優勢的無細胞合成生物學檢測方法，在多種農藥的特異性檢測方面取得一定的研究成果。這些傳感器大多通過設計巧妙的特異性響應，使得在特定農藥分子存在時出現易于監測的陽性信號，大大方便了農殘檢測[20]。相比傳統方法，這些新方案存在諸多優勢（表2），其不需要大而昂貴的精密儀器，也不需要復雜的運輸和前處理過程，更加具有現場檢測、原位監測的潛力，在商業化上也更有成本優勢。

但是，合成生物學在農藥檢測中的應用尤其是全細胞傳感器仍然面臨著眾多挑戰。全細胞生物傳感器一般無法達到化學檢測的精度，而且在很多情況下由于報告基因的表達所需的時間而造成延長響應，此外如何在營養缺乏甚至是含毒性化合物的環境下保存細胞活力也是必須考慮的問題[88]。針對上述問題，研究人員試圖通過精制宿主植株[89]、設計更敏感的啟動子[90]、使用表面展示的蛋白[91]等提高微生物傳感器的特異性、敏感性并減少響應時間[92]。選擇水凝膠[93]等材料進行封裝，提升安全性同時方便儲存。

近年來各種各樣的合成生物學檢測方案正在進行從實驗室走向實際推廣應用的嘗試。一方面這需要克服前文提到的檢測限、特異性和培養條件等限制，另一方面也必須考慮生物安全問題。這不僅要求研究人員加強生物控制，也要求在應用前對微生物衍生傳感器對生態環境和人類健康的潛在影響進行更系統的評估[88]。在未來，微生物傳感器也將向著更自動化、更精細的無細胞系統發展，具有廣闊的前景[89]，合成生物學勢必在其中起到關鍵性的作用。