黑茶菌添加量對包包曲培菌過程品質的影響

范斌強 吳浩人 余有貴 劉安然 熊 翔

(1.邵陽學院食品與化學工程學院，湖南 邵陽 422000；2.生態釀酒技術與應用湖南省高校重點實驗室，湖南 邵陽 422000；3.湖南省茶業集團股份有限公司，湖南 長沙 410000；4.湖南湘窖酒業有限公司，湖南 邵陽 422000)

白酒生產過程中，大曲為白酒發酵提供霉菌、酵母菌、細菌以及酶類[1]，因此控制大曲質量是白酒釀造的關鍵[2]。大曲是通過富集自然環境中各種微生物經發酵培養制成[3]，而強化大曲是將分離出來具有某種特定功能的微生物添加到大曲的制曲原料中[4]，以增強大曲的某種性能，從而提高釀酒原料的出酒率或改善白酒的品質。Li等[5]將片球菌、酵母菌等純種微生物接種至酒曲中，豐富了大曲中微生物群落結構。劉宇[6]通過添加純種細菌和霉菌至醬香大曲中，改善了白酒的風味。姜鵬[7]將高產酯的酵母菌添加至大曲中提高了出酒率和白酒中總酸、總酯含量。王曉娜[8]研究了夏秋茶制作大曲的工藝對大曲品質和固態發酵茶酒的影響。冠突散囊菌(Eurotium cristatum)又稱金花菌，是茯磚茶在適宜條件下，通過“發花”工藝生長的有益菌[9]。冠突散囊菌在發酵期間會通過代謝產生對人體健康有益的產物，使茯磚茶具有降血糖、抗氧化以及調節腸胃等功能[10]。目前，冠突散囊菌的研究大多集中在分離鑒定[11]、抑菌活性[12]、工藝優化[13]、抗氧化性[14]等方面，關于冠突散囊菌的黑茶培養物制成強化大曲方面的研究尚未見報道。研究擬以偏高溫包包曲制作工藝為基礎，采用含冠突散囊菌黑茶制備強化大曲，對培菌管理過程中主要微生物類群、酶活力和常規理化指標的動態變化進行對比分析，探索黑茶強化大曲與傳統大曲的差異，為黑茶大曲的開發和提高酒曲的糖化力提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

黑毛茶：要求黑褐油潤、緊結肥壯，湖南省茶業集團股份有限公司；

冠突散囊菌：從傳統黑茶的金花中分離獲得，湖南省茶業集團股份有限公司；

黑茶菌：根據參考文獻[15]的研究方法進行制備改良，以黑毛茶為原料，殺菌處理后接種冠突散囊菌菌懸液，發酵條件為接種量9%，料液比1.0∶14.5 (g/mL)，發酵時間125 h，干燥后獲得黑茶菌培養物，簡稱黑茶菌，用于包包曲強化，生態釀酒技術與應用湖南省高校重點實驗室；

小麥：選用顆粒飽滿，無蟲害的小麥，粉碎過20目篩，湖南湘窖有限公司；

葡萄糖、瓊脂、蛋白胨、可溶性淀粉、酒石酸鉀鈉、濃鹽酸、氫氧化鈉、次甲基藍等：分析純，邵陽市科儀化玻有限公司。

1.1.2 主要儀器和設備

恒溫培養箱：DH-420型，北京科偉永興儀器有限公司；

恒溫水浴鍋：DK-99-3型，江蘇金壇中大儀器廠；

磁力攪拌器：HJ-1型，常州越新儀器制造有限公司；

自動壓力蒸汽滅菌器：GI54DWS型，致微(廈門)儀器有限公司；

《蒲團》的創作時間是明治40年。正是日俄戰爭結束的時候。那個時候，日本的現代化的速度變快了。生駒夏美在論文中如此寫道。“也就是說，即使不能否認明治維新要將日本變身為西洋的近代國家而出發了，但這一想法并非等同于大家的共享，而且，西方的壓力和思想也廣泛流傳下來了嗎？正是因為他們出現了強烈的反對和反動，所以也產生了江戶時代以前日本存在的愿望吧。當時的日本無論是技術還是外表都是西洋化的，但內心的根本就是日本式。日本的封建思想又深深地留在了人們的心中。封建思想的力量很強。當時的日本人崇尚西方文明，但它只停留在行為和服裝等水上。由于日本的傳統文化和西方文明的根本不同，西方文明也無法徹底接受。

便攜式pH計：LE438型，梅特勒—托利多儀器(上海)有限公司；

超凈工作臺：SW-CJ-1FD型，蘇州智凈凈化設備有限公司。

1.2 工藝流程

以湖南湘窖酒業有限公司的偏高溫包包曲的制曲工藝為基礎，以常規小麥包包曲為對照組，每塊曲坯重3.2 kg；分別按小麥重量的5%，10%，15%，20%添加黑茶菌，經混合潤糧，制備曲坯，每個添加量制作10塊曲坯、3批次，經入室安曲、培菌管理制成新曲，其工藝流程圖如圖1所示[16]。

圖1 黑茶曲工藝路線Figure 1 Technological route of dark tea Jiuqu

1.3 試驗方法

1.3.1 培養基配制

(1) 孟加拉紅培養基：蛋白胨5 g、磷酸二氫鉀1.0 g、硫酸鎂0.5 g、葡萄糖10.0 g、氯霉素0.1 g、孟加拉紅0.033 g、瓊脂20.0 g，蒸餾水1 000 mL。

(2) 營養瓊脂培養基：蛋白胨10 g、牛肉膏3 g、氯化鈉5 g、瓊脂15～20 g，蒸餾水1 000 mL。

(3) 察氏瓊脂培養基：硝酸鈉3 g、磷酸氫二鉀1 g、硫酸鎂0.5 g、氯化鉀0.5 g、硫酸亞鐵0.01 g、蔗糖30 g、瓊脂15 g，pH (6.2±0.2)，蒸餾水1 000 mL。

1.3.2 微生物的培養與計數 準確稱取25 g大曲粉至裝有225 mL無菌稀釋液的三角瓶中，充分振蕩，取1 mL至裝有9 mL無菌稀釋液的試管中，得到10-2稀釋液，依次操作得到10-3，10-4，10-5稀釋液。吸取1 mL稀釋液加至培養皿中，倒入溫度適中的營養瓊脂培養基、孟加拉紅培養基養基、察氏瓊脂培養基，搖晃混勻，待凝固后倒置，營養瓊脂培養基放入35 ℃培養箱中，其余放入28 ℃培養箱中，培養1～2 d，分別對細菌、酵母菌、霉菌和冠突散囊菌進行計數。

1.3.3 大曲的理化指標與酶活檢測 參照QB/T 4257—2011《釀酒大曲通用分析方法》。

2 結果與分析

2.1 對培菌過程中微生物類群動態變化的影響

2.1.1 霉菌和冠突散囊菌 由表1可知，隨著發酵時間的增加，霉菌數量先升后降，并在培菌第3天達最大值。隨著發酵時間的增加，大曲溫度逐漸升高，霉菌生長受到抑制，霉菌數量開始減少；隨著大曲溫度的降低，霉菌數量略有回升，并在入庫時趨于穩定。黑茶曲添加組的霉菌數量與傳統大曲對照組之間呈顯著變化(P<0.05)。培菌前期，溫度、濕度適宜，霉菌數量增加，培菌第2天，各黑茶曲添加組之間差異顯著(P<0.05)；隨著發酵時間的增加，大曲溫度在培菌第8天達到頂溫，15%黑茶菌添加組的霉菌數與對照組之間差異顯著(P<0.05)；隨著大曲溫度的降低，傳統大曲對照組的霉菌與黑茶菌添加組之間差異顯著(P<0.05)。在培菌管理結束的第28天入庫時，15%和20%黑茶菌添加組的霉菌數與對照組之間差異顯著(P<0.05)且協同促進霉菌的生長；15%和20%黑茶菌添加組的霉菌數量與5%，10%黑茶菌添加組之間存在顯著性差異(P<0.05)，但5%和10%黑茶菌添加組之間的差異不顯著。

表1 大曲中霉菌總數的動態變化?Table 1 Total number of molds in different Aspergillus ×105 CFU/g

考慮到培菌管理前、中期冠突散囊菌在小麥培養基中生長不明顯，故只在培菌結束的新曲入庫時進行檢測。由表2可知，強化大曲中有冠突散囊菌檢出，說明冠突散囊菌能夠在小麥包包曲中生長繁殖。

表2 培菌第28天大曲中冠突散囊菌總數Table 2 Total number of Corona aspergillus in different Daqu ×105 CFU/g

2.1.2 酵母菌 由表3可知，隨著發酵時間的增加，酵母菌先升后降再緩慢上升。主要原因在于培菌前期溫度適宜，大曲中酵母菌大量繁殖；而當發酵溫度上升至50 ℃時，超過酵母菌最佳生長繁殖溫度，酵母菌生長處于抑制狀態；發酵培菌后期隨著溫度的降落，酵母菌略有增加，但基本處于穩定狀態。黑茶菌添加組的酵母菌數量與傳統大曲對照組之間差異顯著(P<0.05)。培菌第3天，5%黑茶菌添加組的酵母菌數量與傳統大曲對照組之間無顯著性差異，但其他黑茶菌添加組與傳統大曲對照組之間呈顯著性差異(P<0.05)。進入高溫發酵階段，酵母菌數量降低，培菌第12天，黑茶菌添加組與傳統大曲對照組之間存在顯著性差異(P<0.05)。隨著大曲溫度的降低，傳統大曲對照組的酵母菌數量與其他黑茶添加組之間差異顯著(P<0.05)。在培菌管理結束的第28天入庫時，黑茶菌添加組的酵母菌數量與傳統大曲對照組之間差異顯著(P<0.05)且抑制酵母菌的生長；但各黑茶菌添加組之間的酵母菌數量差異不顯著。酒曲中黑茶菌、霉菌和酵母菌的生長繁殖均需要耗氧，可能是黑茶菌、霉菌的生長繁殖能力強，對酵母菌具有競爭性抑制作用，從而在大曲中強化黑茶菌會相對減少酵母菌的數量。

表3 大曲中酵母菌總數的動態變化?Table 3 Total number of yeast in different Daqu ×105 CFU/g

2.1.3 細菌 由表4可知，培菌前期養分比較充足，細菌數量在入房前3 d增加，隨著發酵時間的延長，大曲溫度升高，不耐高溫的微生物數量減少，細菌在第4天時處于最大值，此時溫度恰好適合耐高溫的細菌生長繁殖；進入高溫發酵培菌階段后，細菌開始減少。隨著大曲溫度的下降，細菌數量有所回升。黑茶菌添加組的細菌數量與傳統大曲對照組之間差異顯著(P<0.05)。大曲培養第2，3天，5%黑茶菌添加組的細菌數量與傳統大曲對照組之間無顯著差異，但其他黑茶菌添加組的細菌數量與傳統大曲對照組之間差異顯著(P<0.05)。在培菌管理結束的第28天入庫時，黑茶菌添加組的細菌數量與傳統大曲對照組之間差異顯著(P<0.05)且抑制細菌的生長；且5%的黑茶菌添加組的細菌數量與其他各添加量之間差異顯著(P<0.05)。

表4 大曲中細菌總數的動態變化?Table 4 Total number of bacteria in different Daqu ×105 CFU/g

2.2 對培菌過程中理化指標的影響

2.2.1 大曲溫度 由圖2可知，大曲溫度隨發酵時間的增加先增加后緩慢下降，第5天時達到頂溫58 ℃，共持續7 d；第12天大曲溫度緩慢降低，第16天時大曲溫度降至室溫(26 ℃)，符合中高溫大曲“前緩中挺后緩落”的變化趨勢。第28天入庫，大曲溫度為20 ℃。

圖2 大曲溫度的變化趨勢Figure 2 Trend of temperature variation of different Daqu

2.2.2 水分 由圖3可知，隨著發酵時間的增加，大曲的水分含量迅速降低。大曲剛入房成“川”字擺放，有助于水分揮發。培菌前期，大曲溫度較低，水分減少較緩。隨著發酵時間的增加，大曲進入高溫發酵階段，水分開始迅速降低。第28天入庫，各黑茶菌添加組的大曲水分維持在15%左右，說明大曲水分變化與大曲溫度密切相關。

圖3 大曲水分動態變化圖Figure 3 Dynamicchanges of water in different Daqu

2.2.3 酸度 由圖4可知，培菌第1～4天，產酸微生物迅速繁殖，酸度增加；培菌第5～11天，進入高溫發酵階段，不耐高溫的微生物開始死亡，酸度降低，此階段大曲溫度維持在58 ℃左右；培菌第12～16天，大曲溫度逐漸降低，微生物開始生長繁殖，酸度增加。第28天入庫時，大曲溫度趨于室溫，微生物死亡與代謝速率基本維持穩定，酸度也基本維持穩定。

圖4 大曲酸度動態變化圖Figure 4 Dynamicchanges of acidity of different Daqu

2.2.4 淀粉含量 由圖5可知，淀粉含量在整個發酵過程中呈下降趨勢。培菌前期，合適的溫度導致微生物數量快速增加，并且由于淀粉是多糖，為大曲中微生物生長提供所需的能量，因此微生物對原料中淀粉分解和消耗增加；進入高溫發酵期后，大量微生物死亡導致對淀粉的利用率降低，淀粉含量趨于平緩；第28天入庫時，大曲溫度趨于室溫，且水分含量降低，微生物生長趨于平衡，微生物對淀粉的消耗比較穩定。

圖5 大曲淀粉含量動態變化圖Figure 5 Dynamic changes of starch content in different Daqu

2.3 對培菌過程中酶活力的影響

2.3.1 發酵力 由圖6可知，發酵力在整個發酵過程中先升高后降低。培菌前期，發酵力開始增加；培菌第5～12天進入高溫發酵期，微生物的生長繁殖速度降低，發酵力隨溫度的升高開始降低；進入高溫發酵后期，溫度降低，微生物數量緩慢回升，發酵力基本維持穩定。

由圖6還可知，黑茶菌添加組的發酵力與傳統大曲對照組之間差異顯著(P<0.05)。培菌第2天，10%和20%的黑茶菌添加組的發酵力與傳統大曲對照組之間差異顯著(P<0.05)；但培菌第3，4，8，12天，有部分黑茶菌添加組的發酵力與傳統大曲對照組之間差異顯著(P<0.05)；培菌第16天，茶曲試驗組發酵力與對照組之間差異顯著(P<0.05)；在培菌管理結束的第28天入庫時，5%和10%的黑茶菌添加組的發酵力與傳統大曲對照組之間無差異顯著(P>0.05)，15%和20%的黑茶菌添加組的發酵力與傳統大曲對照組之間差異顯著(P<0.05)，且能顯著提高大曲的發酵力。大曲中功能霉菌以曲霉和根霉為主，其中黑曲霉和根霉含有較強的酒化酶，有產乙醇能力[17]，試驗以15%和20%含冠突散囊菌的黑茶菌制備強化大曲，雖然競爭性抑制了發酵力強的酵母菌的生長繁殖，但可能是霉菌數量顯著增多而具有較強的發酵力，因此試驗組的發酵力有明顯提升。

圖6 大曲發酵力動態變化Figure 6 Dynamic changes of fermentation power of different Daqu

2.3.2 液化酶活力 由圖7可知，大曲的液化力在入庫發酵時為0，培菌前期微生物開始生長繁殖，液化力增加；液化力在高溫發酵期開始降低；培菌第12～16天，溫度逐漸趨于室溫，液化力升高，是由于此時微生物開始繁殖。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖7 大曲液化力動態變化Figure 7 Dynamic changes of Daqu liquefaction force

由圖7還可知，黑茶菌添加組的液化力與傳統大曲對照組之間差異顯著(P<0.05)。培菌第2天，黑茶菌添加組的液化力與傳統大曲對照組之間無顯著差異；但培菌第3，4，8，12，16天，有部分黑茶菌添加組的液化力與傳統大曲對照組之間差異顯著(P<0.05)，且15%和20%的黑茶菌添加組的液化力與傳統大曲對照組之間差異顯著(P<0.05)。在培菌管理結束的第28天入庫時，黑茶菌添加組的液化力與傳統大曲對照組之間差異顯著(P<0.05)且能顯著提高大曲的液化力；各黑茶菌添加組之間的液化力無顯著差異。

2.3.3 糖化酶活力 由圖8可知，大曲剛進入培菌期時，由于原料中帶有一定量的糖化酶，因此大曲具有很高的糖化力，隨著發酵時間的增加，環境溫度升高，微生物大量死亡，尤其是霉菌的大量死亡，微生物代謝產生的酶量減少，糖化力較大幅度降低；培菌第12～16天，糖化力有所回升；第28天入庫時，糖化力均維持在穩定狀態。

由圖8還可知，黑茶菌添加組的糖化力與傳統大曲對照組之間差異顯著(P<0.05)。培菌第2天，只有10%黑茶菌添加組的糖化力與傳統大曲對照組之間差異顯著(P<0.05)；培菌第3天，黑茶菌添加組的糖化力與傳統大曲對照組之間差異顯著(P<0.05)且能顯著提高糖化力；培菌第4天，15%和20%的黑茶菌添加組的糖化力與傳統大曲對照組之間差異顯著(P<0.05)且能顯著降低糖化力；培菌第8天，5%，15%和20%的黑茶菌添加組的糖化力與傳統大曲對照組之間差異顯著(P<0.05)且能顯著降低糖化力；培菌第12天，只有15%黑茶菌添加組的糖化力與傳統大曲對照組之間差異顯著(P<0.05)且能顯著提高糖化力；培菌第16天，黑茶菌添加組的糖化力與傳統大曲對照組之間差異顯著(P<0.05)，其中20%的黑茶菌添加組能顯著提高糖化力，但其他黑茶菌添加組能顯著降低糖化力。第28天入庫時，除10%的黑茶菌添加組外，其他3個黑茶菌添加組的糖化力與對照組之間差異顯著(P<0.05)，且15%和20%的黑茶菌添加組能顯著提高大曲的糖化力，但5%的黑茶菌添加組能顯著降低大曲的糖化力；且各黑茶菌添加組之間的糖化力均有顯著性差異(P<0.05)。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖8 大曲糖化力動態變化Figure 8 Dynamic changes of Daqu saccharification power

3 結論

在培菌管理的28 d內，與傳統大曲對照組相比，各黑茶菌添加組會引起微生物類群數量(霉菌、酵母、細菌和冠突散囊菌)、常規理化指標(培菌溫度、酒曲水分、酸度和淀粉含量)和酶活力(發酵力、液化力和糖化力)均有不同程度的變化，且各黑茶菌添加組之間也呈不同程度的變化。在傳統偏高溫包包曲中，采用含冠突散囊菌的黑茶菌培養物進行強化，在培菌管理結束的第28天入庫時，15%和20%的黑茶菌添加組的霉菌、細菌和酵母數量與傳統大曲對照組之間差異顯著(P<0.05)，說明黑茶菌的添加能顯著促進大曲中霉菌的生長繁殖、抑制大曲中細菌和酵母菌的生長繁殖；同時，15%和20%的黑茶菌添加組的液化力和糖化力與傳統大曲對照組之間呈顯著性差異(P<0.05)，說明黑茶菌的添加能顯著提高大曲的液化力和糖化力。利用現代分子生物技術，后續可進一步對黑茶菌強化大曲微生物區系的作用機理進行分析。