NDRG2通過抑制Bcl-2表達增加膀胱癌細(xì)胞對順鉑的敏感性

李瑞曉，唐啟勝，馬善金，張 波，李雪蓮，張志明

1.空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院泌尿外科，陜西 西安 710038；2.西安市中醫(yī)醫(yī)院外科，陜西 西安 710002

目前，晚期膀胱癌的治療主要是基于順鉑（cisplatin，CDDP）的輔助治療，在根治性膀胱切除術(shù)前/后或晚期輔以CDDP為主的化療是目前的主要治療手段［1］。然而，由于對化療藥物的耐藥性產(chǎn)生，CDDP的療效有限，化療有效率約為50%。Bcl-2在與抗癌藥物（如CDDP）誘導(dǎo)的DNA損傷相關(guān)的細(xì)胞凋亡中起關(guān)鍵作用，Bcl-2的過表達賦予了細(xì)胞多藥耐藥性，并且臨床數(shù)據(jù)已將Bcl-2表達水平與CDDP耐藥和復(fù)發(fā)性疾病聯(lián)系起來［2］。N-Myc下游調(diào)節(jié)基因2（N-Myc down stream-regulated gene 2，NDRG2）是一種新發(fā)現(xiàn)的p53誘導(dǎo)基因，被認(rèn)為參與DNA損傷誘導(dǎo)的p53相關(guān)凋亡途徑并在抑制增殖中發(fā)揮作用。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，NDRG2基因的過表達可在體內(nèi)/外抑制膀胱腫瘤的增殖及侵襲能力［11］。鑒于先前的研究，關(guān)于NDRG2基因在膀胱癌耐藥機制的研究比較少，因此本研究旨在探討NDRG2是否通過與Bcl-2相互作用而影響膀胱癌細(xì)胞耐藥的形成，為臨床治療晚期膀胱癌提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人膀胱癌細(xì)胞系T24購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫，并在含有10%胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）的DMEM中于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的溫箱中培養(yǎng)。為了培育出抗CDDP的亞型，將T24細(xì)胞于含有CDDP（濃度遞增：0.1～1.0 μg/mL）的培養(yǎng)基中連續(xù)傳代，持續(xù)6個月。最終將CDDP抗性細(xì)胞株于含有1 μg/mL CDDP的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

1.2 基因修飾和轉(zhuǎn)染

將編碼全長NDRG2的cDNA亞克隆到pcDNA3.1載體（美國Invitrogen公司）中，通過轉(zhuǎn)染構(gòu)建NDRG2基因過表達T24細(xì)胞株，同時采用小干擾RNA（siRNA）技術(shù)構(gòu)建NDRG2及Bcl-2基因沉默細(xì)胞株。根據(jù)制造商的說明書，使用LipofectamineTM2000（美國Invitrogen公司）用相應(yīng)的分子克隆載體轉(zhuǎn)染目的細(xì)胞。

1.3 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測

將膀胱癌細(xì)胞溶解于蛋白裂解液［寶生物工程（大連）有限公司］提取目的細(xì)胞的總蛋白。通過十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分離細(xì)胞裂解物并轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。選取NDRG2、Bcl-2、多藥耐藥蛋白一抗（美國Santa公司）與NC膜溫育過夜，然后在與目的蛋白匹配的辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗中溫育。用計算機-熒光掃描儀系統(tǒng)對膜進行掃描，進行數(shù)據(jù)分析。

1.4 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）

嚴(yán)格按照提取試劑盒（美國Invitrogen公司）操作說明進行，使用TRIzol試劑從膀胱癌細(xì)胞中提取總RNA。將提取的RNA在紫外分光光度計下檢測，讀取260 nm處的吸光度（D260nm）值以及D260nm/D280nm比值，按照美國Invitrogen公司反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)將RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。每個PCR程序：35個循環(huán)（對于NDRG2基因），94 ℃ 30 s，52 ℃ 40 s，72 ℃ 40 s；共25個循環(huán)（對于Bcl-2基因），在94 ℃ 30 s，62 ℃ 30 s和72 ℃ 30 s，然后72 ℃，延伸10 min。通過2-ΔΔCt法計算各組mRNA表達量并進行比較，最后進行數(shù)據(jù)分析。

1.5 細(xì)胞毒性測定

MTT法分析CDDP對膀胱癌細(xì)胞生長的影響。調(diào)整細(xì)胞濃度1×104個/mL以200 μL等分接種到96孔板中。加入不同濃度的CDDP在37 ℃下溫育72 h后，向每個孔中加入20 μL的MTT溶液（5 mg/mL），并將96孔板在37 ℃下再溫育4 h。然后除去培養(yǎng)基并用150 μL 100%DMSO代替，攪拌溶解5～10 min。使用多孔掃描分光光度計在490 nm處測量D值。細(xì)胞活力表示為未處理細(xì)胞的百分比。每種實驗條件重復(fù)3次。

1.6 檢測細(xì)胞凋亡

將膀胱癌細(xì)胞用CDDP（所需濃度）處理 24 h。用熒光素異硫氰酸酯標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白Ⅴ和碘化丙錠染色凋亡細(xì)胞。使用熒光細(xì)胞分選儀測量凋亡細(xì)胞。

1.7 Transwell小室檢測

采用transwell小室檢測確定細(xì)胞的侵襲能力。將目的細(xì)胞培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞。將細(xì)胞（2×104個細(xì)胞/孔）重懸于200 μL無血清培養(yǎng)基中，并置于上室中。底部腔室覆蓋有500 μL RPMI-1640和20%FBS。溫育36 h后，將膜固定并分別使用4%多聚甲醛和結(jié)晶紫染色。然后在光學(xué)顯微鏡下計數(shù)侵襲的細(xì)胞。所有實驗均包括3個獨立的重復(fù)。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

選用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 19.0進行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)表示為。通過使用單向ANOVA及組間χ2檢驗來進行統(tǒng)計學(xué)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué) 意義。

2 結(jié)果

2.1 CDDP不同濃度處理下T24、T24/CR細(xì)胞中NDRG2蛋白的表達情況

通過濃度遞增的方式用CDDP處理膀胱癌T24細(xì)胞，然后通過分光光度法評估不同濃度CDDP處理T24細(xì)胞和CDDP抗性細(xì)胞（表示為T24/CR）的活力狀態(tài)以及NDRG2蛋白的表達水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在濃度＜1 μg/mL時，T24/CR細(xì)胞具有繼續(xù)生長的抗性（圖1A）。Western blot結(jié)果顯示，與親代T24細(xì)胞相比，T24/CR細(xì)胞中NDRG2的表達水平顯著下調(diào)（圖1B）。此外，低濃度CDDP處理T24細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)其以時間依賴性方式刺激NDRG2表達（圖1C）。

圖1 CDDP耐藥的產(chǎn)生影響NDRG2蛋白的表達Fig.1 The development of CDDP resistance affects the expression of NDRG2

2.2 NDRG2蛋白過表達增強了T24細(xì)胞中CDDP的敏感性

將外源性NDRG2基因轉(zhuǎn)染至T24/CR細(xì)胞中并使其穩(wěn)定過表達（圖2A）。通過MTT及凋亡檢測證實，實驗組中T24/CR細(xì)胞的增殖受到顯著抑制，凋亡比例增加（圖2B、C）；在細(xì)胞侵襲實驗中，實驗組T24/CR細(xì)胞的侵襲受到顯著抑制（圖3）。這些研究結(jié)果表明，NDRG2蛋白的過表達可增強CDDP抗T24細(xì)胞的敏感性。

圖2 NDRG2過表達可以影響T24/CR細(xì)胞的活力及凋亡水平Fig.2 Overexpression of NDRG2 could affect the viability and apoptosis of T24/CR cells

圖3 NDRG2過表達可抑制T24/CR耐CDDP細(xì)胞侵襲能力Fig.3 Overexpression of NDRG2 could inhibit resistance to cisplatin in T24/CR cells

2.3 過表達NDRG2抑制T24/CR細(xì)胞中Bcl-2的表達

為了進一步說明NDRG2蛋白在CDDP誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中的作用，通過Western blot檢測T24/CR細(xì)胞中Bcl-2的表達。與T24/CR細(xì)胞相比，過表達實驗組T24/CR細(xì)胞中，Bcl-2的表達受到抑制，P-糖蛋白和多藥耐藥蛋白的表達未受明顯影響（圖4），通過shRNA轉(zhuǎn)染使NDRG2在T24細(xì)胞中低/不表達。隨后用Bcl-2-siRNA瞬時轉(zhuǎn)染下調(diào)了NDRG2在T24細(xì)胞中的表達，并使Bcl-2表達上調(diào)，結(jié)果顯示對NDRG2的表達沒有影響（圖5A），表明NDRG2可能作用于Bcl-2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的上游。

圖4 NDRG2 過表達可抑制T24耐CDDP細(xì)胞中Bcl-2的表達Fig.4 Overexpression of NDRG2 could inhibit the expression of Bcl-2 in T24/CR cells

2.4 Bcl-2基因的抑制修復(fù)了NDRG2基因的缺陷，恢復(fù)膀胱癌細(xì)胞對CDDP的敏感性

我們研究了NDRG2對Bcl-2基因的激活是否通過改變T24細(xì)胞活力和細(xì)胞凋亡而引起CDDP抗性。用0.5 μg/mL CDDP溫育24 h導(dǎo)致T24細(xì)胞活力顯著降低和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而NDRG2的表達抑制導(dǎo)致T24細(xì)胞活力增強和凋亡減弱而引起明顯的CDDP抗性。更重要的是，下調(diào)Bcl-2的表達可有效解除NDRG2低表達對T24細(xì)胞活力和凋亡的影響，并恢復(fù)CDDP對T24細(xì)胞的敏感性（圖5B、C）；反過來，增加NDRG2的表達，可增強CDDP誘導(dǎo)T24細(xì)胞凋亡的敏感性。

圖5 NDRG2調(diào)節(jié)Bcl-2的表達Fig.5 NDRG2 regulated the expression of Bcl-2

3 討 論

鉑類藥物，特別是CDDP，被廣泛用于治療多種實體惡性腫瘤，包括膀胱癌。然而，一些腫瘤患者在治療前或治療過程中會出現(xiàn)對CDDP的耐藥性。CDDP的耐藥率高也是腫瘤患者化療失敗的主要原因。雖然最近提出了CDDP耐藥的靶前、靶上、靶后和脫靶機制學(xué)說［3］，但CDDP耐藥的分子機制仍不完全清楚。

Bcl-2在線粒體凋亡中起關(guān)鍵作用，Bcl-2的表達可以預(yù)測接受放化療的晚期膀胱癌患者的存活率［12］，Bcl-2蛋白表達的上調(diào)可能是膀胱癌細(xì)胞出現(xiàn)CDDP耐藥的機制之一，通過下調(diào)Bcl-2的表達有助于逆轉(zhuǎn)膀胱癌細(xì)胞對CDDP耐藥 性［13］。NDRG2對細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)有兩種相反報道，NDRG2在局灶性腦缺血中表現(xiàn)出抗細(xì)胞凋亡功能［4］，并且在乳腺癌細(xì)胞中具有一定的放射抗性［5］。相反，它在尿路上皮癌［6］、乳腺癌細(xì)胞［7］、肝癌［8］中表現(xiàn)出促凋亡的功能。研究［12］發(fā)現(xiàn)，敲除NDRG2基因可抑制Bcl-2的表達，從而增加宮頸癌HeLa細(xì)胞CDDP敏感 性。我們的前期研究已經(jīng)證實，NDRG2在膀胱癌中發(fā)揮著重要的作用，NDRG2在膀胱癌組織中低表達，并且與患者生存呈負(fù)相關(guān)，體內(nèi)/外實驗證實，過表達NDRG2可抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖及侵襲能力［11］。因此，本研究旨在探討NDRG2可否增加膀胱癌細(xì)胞對CDDP的敏感性，從而改善膀胱癌患者的預(yù)后和生存率。本研究表明，過表達NDRG2可顯著抑制Bcl-2的表達，NDRG2可能通過抑制Bcl-2的表達而誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞的凋亡。NDRG2在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)Bcl-2表達。已有研究［9］表明，Bcl-2可被胃癌細(xì)胞中的microRNA（如miR-15b和miR-16）靶向和調(diào)節(jié)。這些microRNA與Bcl-2 mRNA的3’非翻譯區(qū)結(jié)合，抑制Bcl-2蛋白的翻譯而不改變mRNA表達。Bcl-2的上調(diào)是某些腫瘤對放化療產(chǎn)生耐藥的原因之一［10］。然而，目前對化療反應(yīng)中控制Bcl表達的轉(zhuǎn)錄后或翻譯后調(diào)控機制知之甚少。

本研究發(fā)現(xiàn)，上調(diào)NDRG2的表達后，T24/CR耐藥細(xì)胞的凋亡比例增加，且侵襲性受到抑制，同時Bcl-2的表達受到抑制。是否NDRG2的表達調(diào)節(jié)了Bcl-2的表達，我們進一步進行了驗證，通過siRNA技術(shù)使NDRG2在T24細(xì)胞中低/不表達。更重要的是，下調(diào)Bcl-2的表達可有效解除NDRG2低表達對T24細(xì)胞活力和凋亡的影響，并恢復(fù)CDDP對T24細(xì)胞的敏感性；反過來，增加NDRG2的表達，可增強CDDP誘導(dǎo)T24細(xì)胞凋亡的敏感性。

研究表明，NDRG2與CDDP的敏感性增加有關(guān)，而細(xì)胞的耐藥與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的Bcl-2有關(guān)，本研究證實NDRG2可調(diào)控Bcl-2的表達從而增加膀胱癌CDDP敏感性。這些數(shù)據(jù)可以幫助我們更好地了解CDDP耐藥的分子機制以及NDRG2在腫瘤發(fā)展中的確切作用。