蛋白激酶CβⅡ通過IL-6自分泌途徑促進肝細胞癌侵襲的研究

劉 敏，陳添亮，郭 娟，伊 雪，高洪泉，巫佳翠，王玉孝

1.廈門醫學院基礎醫學部，福建 廈門 361023；2.機能與臨床轉化福建省高等學校重點實驗室，福建 廈門 361023；3.廈門醫學院臨床醫學系，福建 廈門 361023；4.廈門醫學院附屬第二醫院病理科，福建 廈門 361023

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是全球第七大高發和第四大致死性的惡性腫 瘤［1］，中國是HCC大國，世界上每年近半數HCC新發和死亡病例均發生在中國［2］，雖然近年來對HCC的基礎和臨床研究有諸多進展，但HCC患者預后仍然很差，5年生存率僅10%［3］。HCC的復發轉移是導致HCC患者死亡率居高不下的主要原因，深入研究其轉移的機制，探究更加精確有效的治療靶點一直是HCC研究的重點和難點。越來越多的證據表明，在HCC發生、發展的過程中，腫瘤微環境與腫瘤細胞的增殖、侵襲及轉移密切相關［4］，腫瘤細胞或者腫瘤微環境中的細胞分泌的多種促炎因子、趨化因子等參與腫瘤的轉移［5］，尤其是腫瘤細胞源性細胞因子可以通過自分泌途徑參與腫瘤的生長、存活及轉 移［6］，或通過旁分泌途徑重塑基質［7］，促進腫瘤的發展。蛋白激酶CβⅡ（protein kinase CβⅡ，PKCβⅡ）屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶C家族，參與細胞增殖、存活、血管新生等生物學過程，PKCβⅡ在多種腫瘤中表達上調［8-10］，其高表達提示患者預后不良［11］。肺癌細胞高表達PKCβⅡ可以提高細胞的增殖、遷移能力［12］；胃癌中PKCβⅡ的激活參與斯鈣素（stanniocalcin-1，STC-1）［13］介導的血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表達，促進胃癌生長及血管新生，上述研究均表明PKCβⅡ在腫瘤的發展過程中發揮重要的作用。我們前期的研究［14］發現，PKCβⅡ通過調控上皮-間質轉化介導HCC的轉移，然而PKCβⅡ能否通過調節炎性因子參與HCC的侵襲尚不清楚。本文通過研究PKCβⅡ對HCC侵襲的影響及相關機制，探討PKCβⅡ與腫瘤微環境之間的關系，對深入了解HCC的轉移機制、尋找HCC治療的新靶點具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 細胞系及主要試劑

本實驗所用到的HCC細胞Huh7和Hep3B購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫/中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心，transwell小室（8 μm）購自美國Costar公司，基質膠購自美國BD公司，細胞因子抗體芯片購自美國RayBiotech公司，人白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）酶聯免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒、即用型高效免疫組織化學二抗試劑盒購自愛必信（上海）生物科技有限公司，反轉錄試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，FastStart Essential DNA Green Master購自瑞士Roche公司，IL-6中和抗體、IL-6受體（IL-6 receptor，IL-6R）中和抗體購自美國R&D公司，STAT3和p-STAT3購自美國Cell Signaling Technology公司，PKCβⅡ和IL-6抗體購自美國Abcam公司。

1.2 臨床樣本

選擇2016年5月—2019年12月廈門醫學院附屬第二醫院經病理學檢查確診的HCC患者20例，所有患者均無抗腫瘤治療史。本研究符合廈門醫學院倫理委員會相關規定，患者均自愿參與并簽署知情同意書，標本切除后放置于-80 ℃冰箱保存。

1.3 實驗方法

1.3.1 構建穩定高表達PKCβⅡ的HCC細胞株

將攜帶人PKCβⅡ基因的pLVX-puro-表達載體與pMDLg、pVSV-G、pRSV-Rev包裝質粒在HEK-293T細胞中進行病毒包裝，空載體作為對照組。將HCC細胞接種于2 cm細胞培養皿中，細胞密度40%～50%，第2天換液，加入終濃度為 5 mg/L的聚凝胺（polybrene），病毒冰上融化后滴加到培養液內，混勻，8～12 h后換液繼續培養，以1∶5～1∶3的比例進行細胞傳代，培養過夜，使用1 mg/L的嘌呤霉素（puromycin）對細胞進行篩選，2～3周后得到穩定表達細胞。

1.3.2 收集條件培養基

穩定高表達PKCβⅡ的HCC細胞及對照用無血清DMEM培養基培養24 h，收集細胞上清液，于4 ℃ 300×g離心10 min，去除懸浮細胞及碎片，-20 ℃保存。

1.3.3 Transwell侵襲實驗

用無血清培養基重懸細胞，每孔5×104個細胞，上室中預先加入按1∶6稀釋的基質膠，下室加入完全培養基，培養24 h，PBS洗3次，采用4%多聚甲醛室溫固定30 min，PBS洗3次，結晶紫染色30 min，PBS洗3次，棉簽擦掉上室內的細胞，顯微鏡下每組隨機選取5個視野進行計數，實驗重復3次，每組3個復孔。

1.3.4 細胞因子抗體芯片檢測

使用細胞因子抗體芯片Human Inflammation Array C3（美國RayBiotech公司）檢測細胞上清液中細胞因子的水平，實驗步驟參考廠商提供的方案。簡述如下：收集無血清條件培養基，每個芯片孔中加入100 μL的1×封閉液，室溫搖床上溫育30 min，抽去封閉液，每孔加入100 μL的樣品，4 ℃震蕩溫育過夜，棄去樣品，每孔加入 250 μL的1×洗液Ⅰ，清洗6次，每次震蕩10 s，每孔加入250 μL的1×洗液Ⅱ，清洗5次，每次震蕩10 s，每孔加入70 μL生物素標記抗體（事先用1×封閉液稀釋），室溫溫育1～2 h，洗膜，每孔加入70 μL熒光劑-鏈霉親和素（事先用1×封閉液1∶1 500稀釋），避光室溫震蕩溫育2 h，洗膜，利用GenePix 4000B Microarray Scanner掃描儀，532 nm激發波長進行掃描，采用AAH-INF-G3的數據分析軟件計算各信號點灰度值。

1.3.5 ELISA檢測

收集無血清條件培養基，各孔加入100 μL標準品和實驗樣品，蓋上貼膜，室溫溫育2 h，棄去液體，加入400 μL洗滌液洗滌，重復3次，拍干，每孔加入100 μL IL-6檢測抗體，室溫溫育 2 h，加入400 μL洗滌液洗滌，重復3次，拍干，每孔加入100 μL鏈霉親和素-HRP，室溫避光溫育20 min，加入400 μL洗滌液洗滌，重復3次，拍干，每孔內加入100 μL顯色液，室溫避光溫育 20 min，每孔加入終止液50 μL，終止反應，450 nm波長測量各孔的吸光度（D）值，設定 540 nm作為校正波長。

1.3.6 實時熒光定量聚合酶鏈反應（realtime fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）檢測

將穩定高表達PKCβⅡ的HCC細胞及對照細胞提取總RNA，采用反轉錄試劑盒將等量RNA（2 μg）反轉錄成cDNA，應用Light Cycler 96 RTFQ-PCR儀，使用SYBR GreenⅠ嵌合熒光法，以比較CT值法（2-ΔΔCT法）計 算相對定量。所用到的引物序列I L-6 有義鏈為AGACAGCCACTCACCTCTTCAG，反義鏈為TTCTGCCAGTGCCTCTTTGCTG；I L-6R有義鏈為GACTGTGCACTTGCTGGTGGAT，反義鏈為ACTTCCTCACCAAGAGCACAGC；GAPDH有義鏈為5’-GTCAAGGCTGAGAACGGGAA-3’，反義鏈為5’-AAATGAGCCCCAGCCTTCTC-3’。預溫育95 ℃ 600 s，循環條件95 ℃ 10 s，57 ℃ 10 s，72 ℃ 10 s，共45個循環，溶解95 ℃ 10 s，65 ℃ 60 s，97 ℃ 1 s。

1.3.7 抗體中和實驗

對數生長期的細胞加入I L-6 中和抗體（5 μg/mL）或IL-6R中和抗體（5 μg/mL）預處理1 h，PBS洗3次，胰酶消化，無血清培養基重懸，用于細胞侵襲實驗。

1.3.8 蛋白質印跡法（Western blot）檢測

細胞用冷PBS洗3 次，加入十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）裂解液，提取細胞總蛋白，用二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）試劑盒進行蛋白定量。每組取等量蛋白用10%SDS-PAGE分離蛋白后，以濕轉法轉移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，加入5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入一抗4 ℃溫育過夜，TBST洗膜后，加入辣根過氧化物酶標記的對應二抗，室溫溫育1 h，滴加電化學發光（electrochemical luminescence，ECL）顯影液顯影。以GAPDH作為內參。

1.3.9 免疫組織化學法檢測

取臨床HCC患者癌組織石蠟切片，按照試劑盒說明書進行免疫組織化學染色，DAB工作液顯色，蘇木精復染，鹽酸乙醇分化、脫水，中性樹脂封片。光學顯微鏡觀察PKCβⅡ、IL-6的表達情況。為了進行PKCβⅡ和IL-6的相關性分析，本研究以免疫組織化學染色評分反映PKCβⅡ和IL-6的表達水平，免疫組織化學染色評分=染色強度×陽性細胞比例（%）。染色強度評分標準：不著色，0分；黃色，1分；棕黃色，2分；棕褐色，3分；陽性細胞所占觀察細胞百分比評分標準：＜5%，0分；5%～25%，1分；26%～50%，2分；51%～75%，3分；＞75%，4分。

1.4 統計學處理

所有統計學分析均采用SPSS 22.0軟件進行，結果以表示，實驗兩組間比較采用兩個獨立樣本的t檢驗分析，方差齊且服從正態分布的組間差異采用單因素方差分析，PKCβⅡ和IL-6表達的相關性分析采用非參數Spearman檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PKCβⅡ高表達細胞的條件培養基增強HCC細胞的侵襲能力

本研究采用取自PKCβⅡ穩定高表達HCC細胞組和對照組細胞的條件培養基（conditioned medium，CM）處理HCC細胞Huh7和Hep3B 24 h，通過transwell法檢測細胞侵襲能力的變化。結果顯示，與來自對照組的條件培養基比較，PKCβⅡ高表達細胞的條件培養基能夠顯著增強Huh7的侵襲能力（P＜0.01，圖1A）；在HCC細胞Hep3B中，PKCβⅡ高表達細胞的條件培養基同樣能夠增強細胞的侵襲能力（P＜0.05，圖1B）。上述結果表明，自分泌途徑可能參與了PKCβⅡ的促HCC侵襲作用。

圖1 PKCβⅡ高表達細胞的條件培養基提高HCC細胞的侵襲能力Fig.1 Conditioned medium from PKCβⅡ-overexpressing cells promoted the invasion of HCC cells

2.2 PKCβⅡ促進IL-6的分泌

采用細胞因子抗體芯片檢測PKCβⅡ高表達組和對照組細胞因子分泌的變化，將PKCβⅡ高表達前后細胞因子的相對量進行比較，結果顯示，在表達水平提高的細胞因子中，IL-6的提高最為顯著（圖2A）。ELISA結果顯示，在HCC細胞Hep3B中高表達PKCβⅡ可以提高上清液中IL-6的含量（P＜0.01，圖2B），在HCC細胞Huh7中高表達PKCβⅡ也觀察到了類似的結果（P＜0.01，圖2B）；RTFQ-PCR結果顯示，在HCC細胞Hep3B中高表達PKCβⅡ可以上調IL-6的轉錄（P＜0.01，圖2C），在HCC細胞Huh7中高表達PKCβⅡ也觀察到了類似的結果（P＜0.01，圖2C）。上述結果表明，PKCβⅡ可以促進IL-6的分泌。

圖2 PKCβⅡ促進IL-6的分泌 Fig.2 PKCβⅡ promoted IL-6 secretion

2.3 PKCβⅡ通過IL-6自分泌方式介導HCC細胞的侵襲

為了驗證IL-6是否參與PKCβⅡ的促HCC侵襲作用，抗體中和實驗結果顯示，IL-6中和抗體可以抑制HCC細胞Huh7的侵襲能力（P＜0.05，圖3A），而對PKCβⅡ高表達的Huh7細胞，IL-6中和抗體可以更加明顯地抑制其侵襲能力（P＜0.01，圖3A）；在HCC細胞Hep3B中，IL-6中和抗體對其侵襲能力有所抑制，但差異并無統計學意義（P＞0.05，圖3B），而對PKCβⅡ高表達的Hep3B細胞，IL-6中和抗體可以抑制其侵襲能力的增強（P＜0.01，圖3B）。上述結果表明，PKCβⅡ介導HCC細胞侵襲能力的增強是通過IL-6自分泌方式實現的。

圖3 PKCβⅡ通過IL-6自分泌方式介導HCC細胞的侵襲Fig.3 PKCβⅡ promoted the invasion of HCC cells by modulating the autocrine of IL-6 in vitro

2.4 IL-6/STAT3信號通路參與PKCβⅡ的促HCC細胞侵襲

通過RTFQ-PCR檢測PKCβⅡ高表達HCC細胞Huh7和對照組細胞中IL-6受體的表達，結果表明，PKCβⅡ可以提高IL-6受體的轉錄（P＜0.01，圖4A）；抗體中和實驗的結果顯示，IL-6受體中和抗體可以抑制HCC細胞Huh7的侵襲能力（P＜0.05，圖4B），而對PKCβⅡ高表達的Huh7細胞，IL-6受體中和抗體可以顯著抑制其侵襲能力（P＜0.01，圖4B）；通過Western blot檢測p-STAT3的表達，高表達PKCβⅡ可以上調STAT3的磷酸化（P＜0.05，圖4C），加入IL-6受體中和抗體即可以抑制對照組STAT3的磷酸化（P＜0.05，圖4C），又可以抑制高表達PKCβⅡ介導的STAT3磷酸化上調（P＜0.01，圖4C）。上述結果表明，IL-6/STAT3信號通路參與PKCβⅡ的促HCC細胞侵襲。

圖4 IL-6/STAT3信號通路參與了PKCβⅡ的促HCC細胞侵襲Fig.4 IL-6/STAT3 signal pathway played a role in the invasion of HCC cells by PKCβⅡ

2.5 HCC臨床樣本中PKCβⅡ與IL-6表達的相關性分析

通過免疫組織化學法觀察臨床HCC患者樣本中PKCβⅡ和IL-6表達的相關性。相同標本的連續切片染色反映PKCβⅡ和IL-6表達的正相關性，即隨著PKCβⅡ表達的增加，IL-6的表達也增加（圖5A）；通過比較PKCβⅡ與IL-6的免疫組織化學評分，兩者的表達呈正相關（相關系數r=0.697，P＜0.01，圖5B）。

圖5 HCC臨床樣本中PKCβⅡ與IL-6表達的相關性分析Fig.5 Correlation of PKCβⅡ with the expression of IL-6 in clinical HCC cases

3 討 論

HCC的炎性微環境與HCC的進程是互相促進、交織共存的。在腫瘤的發展過程中，包括腫瘤細胞在內的多種細胞通過釋放細胞因子，如IL-6、白細胞介素-8（interleukin-8，IL-8）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor α，TNF-α）以及花生四烯酸類物質等組成腫瘤的炎性微環境，參與腫瘤的增殖、侵襲和血管生成等［15］。本研究發現，PKCβⅡ通過IL-6自分泌途徑促進HCC的侵襲，提示PKCβⅡ表達失調可以通過炎癥性因子自分泌方式參與HCC的發展過程，揭示了PKCβⅡ調控HCC轉移的新機制，為PKCβⅡ調控腫瘤微環境參與HCC發生、發展提供了依據。

我們前期的研究結果發現，高表達PKCβⅡ可以增強HCC細胞的遷移、侵襲能力［14］，本研究收集PKCβⅡ高表達HCC細胞的條件培養基處理HCC細胞，可以增強細胞的侵襲能力，提示PKCβⅡ促HCC侵襲的能力也可能有自分泌細胞因子的參與。隨后，應用細胞因子抗體芯片技術檢測PKCβⅡ高表達后細胞因子分泌的變化，結果表明，IL-6升高最顯著，普遍上調的促炎因子還包括IL-8、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF）、粒細胞集落刺激因子（granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF）以及干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）等，由此可見，PKCβⅡ促進HCC細胞產生多種促炎因子，招募炎癥細胞，參與構成腫瘤炎癥微環境，促進HCC的發展。

在各種炎性因子中，IL-6被認為是銜接炎癥與腫瘤最核心的因子［16］，在結腸癌［17］、乳腺癌［18］等腫瘤組織及患者血清中均表達升高，其高表達與腫瘤的侵襲及患者的不良預后密切相 關［19］。抗體芯片檢測結果表明，PKCβⅡ高表達可以提高IL-6水平至對照組的11倍，ELISA檢測也發現，PKCβⅡ高表達可以在Huh7和Hep3B中顯著提高上清液中IL-6的水平，RTFQ-PCR也得到相同的結果，提示PKCβⅡ高表達后IL-6從轉錄到分泌水平都明顯增強。關于PKCβⅡ調控IL-6轉錄的分子機制，本研究沒有深入探究，這是本實驗的不足之處。核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）是對炎癥因子具有廣泛調節作用的轉錄因子，靜息狀態下，NF-κB與其抑制劑IκB結合以無活性形式存在于細胞質中，激活后的NF-κB轉位入細胞核，可以與IL-6啟動子中的κB序列結合，調控IL-6的轉錄［20］，同時有研究報道PKCβⅡ可以通過經典信號通路激活 NF-κB［21］，促進慢性淋巴細胞白血病細胞的存活。因此，我們推測PKCβⅡ對IL-6轉錄和分泌的調控可能與NF-κB信號通路有關。

接著我們用IL-6中和抗體預處理HCC細胞，發現可以抑制PKCβⅡ高表達介導的HCC細胞侵襲能力的增強，表明PKCβⅡ通過IL-6自分泌途徑促進HCC細胞的侵襲。IL-6作為腫瘤炎癥微環境中的重要成員，通過與IL-6R結合激活不同的信號轉導通路，IL-6R在包括腫瘤細胞在內的多種細胞表面表達。本研究發現PKCβⅡ可以提高HCC細胞IL-6R的轉錄，用IL-6R中和抗體預處理HCC細胞，PKCβⅡ促HCC細胞侵襲的能力減弱。在IL-6激活的信號通路中，JAK/STAT3信號轉導通路最重要，IL-6通過與IL6-R結合，引起 STAT3磷酸化并形成二聚體，活化的STAT3二聚體轉入細胞核內調控靶基因轉錄［22］，STAT3信號轉導途徑的異常與血管形成及腫瘤轉移關系密 切［23］，本研究發現高表達PKCβⅡ可以提高STAT3的磷酸化，加入IL-6R中和抗體則降低其磷酸化水平，表明PKCβⅡ通過IL-6/IL-6R/STAT3自分泌途徑調控HCC的轉移。

隨著醫療水平的不斷進步，針對 HCC 的治療也取得了長足的發展，手術切除和肝移植仍是目前治療HCC的主要手段，但仍有超過50%的患者會在5年內出現術后復發和轉移［24］。目前缺少有效針對HCC的靶向治療藥物，索拉非尼是目前臨床上治療晚期HCC的一線靶向治療藥物，通過阻斷腫瘤新生血管的形成，抑制腫瘤的轉移和侵襲［25］，盡管索拉非尼在晚期HCC的治療中發揮極為重要的作用，但由于耐藥現象的存在限制了其臨床應用。因此，研發新型的精準靶向治療藥物，對提高HCC的治療及患者預后有著重要的意義。本研究發現，PKCβⅡ通過IL-6自分泌途徑促進HCC的侵襲，調控腫瘤炎癥微環境參與HCC的發展，因此靶向PKCβⅡ有可能成為HCC治療中有效的輔助治療策略。