H2AX磷酸化抑制肺癌細胞發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的作用機制

喬婷婷，葛淑靜，羅 淵，陸承榮，段連寧

1.中國人民解放軍空軍特色醫(yī)學中心臨床醫(yī)學實驗室，北京 100142；2.中國人民解放軍空軍特色醫(yī)學中心干部病房，北京 100142；3.中國人民解放軍空軍特色醫(yī)學中心保健診療科，北京 100142

侵襲轉(zhuǎn)移是臨床腫瘤治療失敗的主要原因，導致90%以上實體瘤患者死亡。而癌細胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-to-mesenchymal transition，EMT）是腫瘤轉(zhuǎn)移啟動和發(fā)生的關(guān)鍵生物學過程［1-2］。EMT一旦啟動，腫瘤細胞之間的黏附能力失去，使得腫瘤細胞獲得遷移和侵襲能力，并向遠端器官或組織轉(zhuǎn)移。因此，抑制EMT無疑是治療腫瘤轉(zhuǎn)移的重要選擇。EMT是一個復雜的多步驟程序性調(diào)控過程，其關(guān)鍵性調(diào)控機制有待于進一步詳細闡明。EMT過程涉及多種基因調(diào)控包括Snail、Slug、Zeb1/2、vimentin、THBS1、VCAN、TGFB2、Twist等間質(zhì)基因的上調(diào)以及上皮基因E-cadherin的下調(diào)［3-4］。根據(jù)報道，血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）/血管內(nèi)皮生長因子受體（vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR）信號轉(zhuǎn)導通路直接參與腫瘤轉(zhuǎn)移過 程［5-6］。腫瘤細胞分泌VEGF刺激血管內(nèi)皮細胞膜上的VEGFR，誘導腫瘤組織血管生成，腫瘤細胞自分泌VEGF刺激其細胞膜上VEGFR，并激活其下游通路raf/MEK/MAPK進而刺激腫瘤細胞啟動EMT和轉(zhuǎn)移［7-8］。臨床標本檢測也顯示，VEGFR家族（VEGFR-1、VEGFR-2和VEGFR-3）在腫瘤組織高表達，但其表達機制不清楚。

H2AX是組蛋白H2A家族的一個變體分子。大量早期研究表明，磷酸化H2AX（γH2AX）被認為參與基因組DNA分子損傷修復［9-10］。中國學者陸承榮等［1］于2006年首次發(fā)現(xiàn)H2AX具有調(diào)控凋亡的作用，基因敲除H2AX后細胞凋亡通路受阻，并詳細揭示絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）家族c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）介導H2AX磷酸化進而調(diào)控凋亡的分子機制［11］。由于H2AX具有調(diào)控凋亡的關(guān)鍵作用，相關(guān)研究也在不斷擴展，尤其與人類重大疾病腫瘤的關(guān)系也陸續(xù)被證明。目前已有大量報道包括本課題組發(fā)表的數(shù)據(jù)，均證明H2AX在腫瘤細胞凋亡時發(fā)揮調(diào)控作用［12-14］。最近，我們又發(fā)現(xiàn)了H2AX新的功能。當抑制小細胞肺癌細胞內(nèi)H2AX時，則強烈刺激肺癌細胞發(fā)生EMT；結(jié)果明確提示，在肺癌細胞EMT過程中H2AX發(fā)揮調(diào)控作用，H2AX磷酸化抑制肺癌EMT，H2AX去磷酸化后則促進EMT。目前有關(guān)H2AX與EMT關(guān)系的研究少見報道，尤其H2AX在肺癌轉(zhuǎn)移中的作用未見發(fā)表。本研究深入探討H2AX磷酸化修飾表觀遺傳調(diào)控肺癌轉(zhuǎn)移的新功能，從全新角度認識肺癌細胞EMT和轉(zhuǎn)移的分子機制，為肺癌等其他腫瘤轉(zhuǎn)移治療提供新的靶向性和特異性更強的候選分子靶點。

1 材料和方法

1.1 細胞來源

人肺癌A549細胞由中國農(nóng)業(yè)大學扈洪波饋贈；A549穩(wěn)定株細胞包括表達野生型H2AX（H2AX-wild type，H2AX-wt）、表達Ser139磷酸化位點突變H2AX（H2AX-139m）、基因沉默穩(wěn)定細胞株H2AX（H2AX-knockdown，H2AXkd）由本實驗室前期制備［15］；H2AX野生型（H2AX+/+）和H2AX基因敲除（H2AX-/-）小鼠胚胎成纖維細胞（mouse embryonic fibroblast，MEF）由美國國家癌癥研究所Andre Nussenzweig提供［11］。

1.2 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測

細胞總蛋白提取如前所述。蛋白樣品通過十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分離，并轉(zhuǎn)到PVDF膜（美國Millipore公司）上，然后把PVDF膜放入洗膜緩沖液（Tris-buffered saline Tween，TBST）配制的5%脫脂奶粉中，室溫下封閉1 h。封閉后的PVDF膜與H2AX磷酸化抗體、E-cadherin抗體、vimentin抗體、H2AX抗體、β-actin抗體（美國Millipore公司）在4 ℃條件下溫育過夜，然后與TBST（5%脫脂奶粉）配制的二抗（日本MBL公司）在室溫下溫育1 h。一抗?jié)舛葹?∶1 000，二抗?jié)舛葹?∶2 000。利用化學發(fā)光試劑SignalFire ECL（美國Cell Signaling Technology公司）檢測蛋白。

1.3 mRNA提取及實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）

總RNA使用TRIzol試劑（美國LifeTechnologies公司）提取。反轉(zhuǎn)錄使用FastQuant RT試劑盒（含gDNA）按說明書執(zhí)行［天根生化科技（北京）有限公司］。E-cadherin mRNA、vimentin mRNA、Slug mRNA、β-cantenin mRNA及β-actin mRNA反轉(zhuǎn)錄按說明書執(zhí)行。RTFQPCR使用SuperRealPreMix Plus試劑盒按廠家說明書執(zhí)行［天根生化科技（北京）有限公司］。β-actin mRNA作為內(nèi)對照。E-cadherin的有義鏈序列為5’-TGGAGGAATTCTTGCTTTGC-3，反義鏈序列為5’-CGCTCTCCTCCGAAGAAAC-3’；vimentin的有義鏈序列為5’-TGGTCTAACGGTTTCCCCTA-3’，反義鏈序列為5’-GACCTCGGAGCGAGAGTG-3’；Slug的有義鏈序列為5’-TGGTTGCTTCAAGGACACAT-3’，反義鏈序列為5’-GCAAATGCTCTGTTGCAGTG-3’；β-cantenin的有義鏈序列為5’-GCTTTCAGTTGAGCTGACCA-3’，反義鏈序列為5’-CAAGTCCAAGATCAGCAGTCTC-3’；β-actin的有義鏈序列為5’-CCAACCGCGAGAAGATGA-3’，反義鏈序列為5’-CCAGAGGCGTACAGGGATAG-3’。RTFQ-PCR反應(yīng)條件：95℃變性10s，退60℃火20s，延伸72℃10s，循環(huán)40次。

1.4 siRNA和轉(zhuǎn)染

VEGFR-2 siRNA和對照siRNA（CTR siRNA）以及轉(zhuǎn)染所需配套試劑均購自美國Santa Cruz Biotechnology公司，具體操作步驟按照說明書進行。首先將含有siRNA的溶液A直接加入到轉(zhuǎn)染稀釋液中，輕輕混勻，在室溫下溫育15～ 45 min待用。然后用siRNA轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基清洗肺癌A549細胞1次，并加入siRNA轉(zhuǎn)染試劑混合物（溶液A+溶液B），在37 ℃、CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細胞5～7 h。

1.5 EMT誘導和檢測

肺癌A549穩(wěn)定株細胞或經(jīng)過siRNA轉(zhuǎn)染的A549細胞血清饑餓24 h后，以5%血清刺激，誘導EMT，然后提取細胞總蛋白和總mRNA，檢測EMT標志性分子E-cadherin和vimentin的蛋白（Western blot）和mRNA水平（RTFQ-PCR），肺癌細胞的遷移和侵襲能力使用transwell試劑（美國Corning公司）按說明書進行。

1.6 統(tǒng)計學處理

所有實驗過程均進行3次獨立重復實驗，實驗數(shù)據(jù)用表示（為3次獨立重復實驗的平均值，s為實驗的標準差），所得數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 22.0進行分析，分析時采用t檢驗或ANOVA進行分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 H2AX基因沉默刺激肺癌A549細胞發(fā)生EMT

為了揭示H2AX是否參與調(diào)控肺癌A549細胞的EMT過程，我們用5%胎牛血清刺激肺癌A549細胞H2AX-kd及其對照細胞穩(wěn)定株（CTR），然后用transwell方法檢測肺癌A549細胞的遷移和侵襲能力。結(jié)果顯示，H2AX基因沉默下調(diào)H2AX后顯著增強A549細胞的遷移（圖1A）和侵襲（圖1B）能力，說明H2AX抑制A549細胞EMT。為了進一步明確H2AX對肺癌細胞EMT的作用，我們提取穩(wěn)定株細胞CTR和H2AX-kd的總蛋白和總RNA，檢測EMT發(fā)生的標志性分子E-cadherin和vimentin的蛋白和mRNA水平。Western blot和RTFQ-PCR結(jié)果一致，均說明血清刺激誘導EMT后，H2AX-kd細胞內(nèi)E-cadherin蛋白（圖1C）和E-cadherin mRNA（圖1D）水平下調(diào)，而vimentin蛋白（圖1C）和vimentin mRNA（圖1D）上調(diào)。在H2AX-kd細胞內(nèi)H2AX蛋白抑制后，H2AX磷酸化也下調(diào)（圖1C）?？傊?，以上實驗結(jié)果明確說明，沉默H2AX基因可以刺激肺癌A549細胞發(fā)生EMT。

圖1 H2AX基因沉默刺激肺癌A549細胞發(fā)生EMTFig.1 Knockdown of H2AX stimulated EMT of lung cancer A549 cells

2.2 H2AX Ser139磷酸化參與肺癌A549細胞EMT

目前普遍認為H2AX功能與其磷酸化作用相關(guān)［16］。H2AX Ser139磷酸化位點磷酸化修飾后，能夠通過表觀遺傳調(diào)控下游基因表 達［17］。為了闡明H2AX抑制EMT是否與其磷酸化有關(guān)，我們把本實驗室前期制備的肺癌A549穩(wěn)定株細胞包括vector（轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒）、H2AXwt和H2AX-139m（抑制H2AX磷酸化作用）進行EMT誘導，然后檢測過表達H2AX和H2AX-139m基因?qū)Ψ伟┘毎鸈MT的影響。結(jié)果說明，過表達H2AX可上調(diào)E-cadherin，下調(diào)vimentin蛋白和mRNA水平（圖2）；H2AX磷酸化位點（Ser139）突變后則相反，下調(diào)E-cadherin，上調(diào)vimentin蛋白和mRNA水平（圖2）。RTFQ-PCR結(jié)果與Western blot結(jié)果一致。Transwell分析結(jié)果也說明過表達H2AX可抑制肺癌細胞的遷移和侵襲能力，H2AX-139m增強A549細胞的遷移和侵襲能力（圖3）。以上結(jié)果提示肺癌細胞EMT與H2AX磷酸化相關(guān)，H2AX磷酸化抑制肺癌細胞EMT。

圖2 H2AX Ser139磷酸化作用調(diào)控E-cadherin和vimentin表達Fig.2 Phosphorylation of H2AX ser139 regulated the expressions of E-cadherin and vimentin

圖3 H2AX磷酸化抑制肺癌A549細胞的遷移和侵襲能力Fig.3 Phosphorylated H2AX inhibited the migration and invasion of lung cancer A549 cells

2.3 H2AX磷酸化下調(diào)VEGFR-2進而抑制肺癌A549細胞EMT

根據(jù)報道，VEGFR-2參與腫瘤EMT的誘發(fā)作用［18］，目前臨床上腫瘤轉(zhuǎn)移治療主要針對VEGFR-2通路。另外，我們曾經(jīng)報道組蛋白H2AX表觀遺傳調(diào)控凋亡基因表達［12］。為探討H2AX是否在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控VEGFR-2表達，我們把肺癌A549基因沉默穩(wěn)定株細胞包括H2AXkd和CTR，以及肺癌A549過表達穩(wěn)定株細胞包括vector、H2AX-wt和H2AX-139m進行EMT誘導，然后提取各種細胞總蛋白執(zhí)行Western blot檢測。結(jié)果說明，肺癌A549細胞H2AX表達抑制后刺激VEGFR-2表達；過表達H2AX阻礙VEGFR-2表達，當抑制H2AX磷酸化后則部分消除H2AX對VEGFR-2表達的抑制作用（圖4A、B）。檢測H2AX基因敲除細胞（H2AX-/-）時獲得同樣的結(jié)果，H2AX基因敲除消除H2AX磷酸化后刺激VEGFR-2表達（圖4C）。以上結(jié)果 證明H2AX磷酸化下調(diào)VEGFR-2。Transwell分析結(jié)果說明，肺癌A549細胞轉(zhuǎn)染VEGFR-2 siRNA后則抑制其遷移（圖5A）和侵襲能力（圖5B），提示VEGFR-2通路確實參與EMT。

圖4 H2AX磷酸化抑制VEGFR-2表達Fig.4 The expression of VEGFR-2 was inhibited by phosphorylated H2AX

我們對VEGFR-2 siRNA的轉(zhuǎn)染效應(yīng)進行了檢測，VEGFR-2 siRNA強烈抑制VEGFR-2的表達（圖5C）。以上結(jié)果表明H2AX磷酸化下調(diào)VEGFR-2進而抑制肺癌A549細胞EMT。

圖5 VEGFR-2基因沉默抑制肺癌A549細胞的EMTFig.5 VEGFR-2 knockout inhibited EMT of lung cancer A549 cells

2.4 H2AX磷酸化調(diào)控肺癌A549細胞Slug和β-catenin表達

Slug是EMT相關(guān)的重要轉(zhuǎn)錄因子［19］，參與腫瘤細胞的EMT調(diào)控。另一種參與腫瘤轉(zhuǎn)移的蛋白β-catenin，主要介導細胞間黏附并參與EMT相關(guān)基因表達。我們利用RTFQ-PCR方法驗證H2AX磷酸化在轉(zhuǎn)錄水平對Slug和β-catenin基因轉(zhuǎn)錄作用的影響。結(jié)果顯示，肺癌A549細胞H2AX表達抑制后（H2AX-kd）上調(diào)腫瘤細胞Slug和β-cateninmRNA水平（圖6A）；過表達H2AX抑制Slug和β-cateninmRNA水平，當阻斷H2AX磷酸化后（磷酸化位點突變）則部分消除H2AX對Slug和β-cateninmRNA水平的抑制作用（圖6B）。因此，H2AX磷酸化除了調(diào)控VEGFR-2表達從而影響腫瘤細胞EMT之外，也參與調(diào)控EMT其他相關(guān)因子Slug和β-catenin的作用。

圖6 H2AX磷酸化調(diào)控EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Slug和β-catenin的表達Fig.6 Phosphorylated H2AX regulated the expressions of EMT-related transcription factors Slug and β-catenin

3 討 論

本課題組曾經(jīng)報道H2AX磷酸化在不同腫瘤細胞中通過不同機制表觀遺傳調(diào)控凋亡基因轉(zhuǎn)錄，進而增強腫瘤細胞凋亡敏感性。在白血病細胞中p38MAPK/H2AX磷酸化通路調(diào)控凋亡蛋白Bim的表達［14］。另外，我們在肺癌細胞中還發(fā)現(xiàn)H2AX磷酸化結(jié)合miR-3196啟動子并抑制miR-3196表達，進而上調(diào)凋亡蛋白PUMA［15］。鑒于H2AX對于腫瘤發(fā)生、發(fā)展和凋亡至關(guān)重要，因此被認為是一種新的抑癌蛋白［20-21］。甚而有人建議，把腫瘤細胞內(nèi)H2AX水平的變化，作為評估腫瘤患者對化療藥物的敏感性或放療的耐受性，指導臨床治療。本研究結(jié)果首次揭示表觀遺傳因子H2AX抑制腫瘤新的作用機制，即H2AX磷酸化通過抑制EMT進而抑制肺癌細胞轉(zhuǎn)移。敲低肺癌A549細胞內(nèi)H2AX表達，則刺激肺癌細胞發(fā)生EMT現(xiàn)象包括vimentin上調(diào)和E-cadherin下調(diào)以及肺癌細胞遷移和侵襲能力的增加；過表達H2AX則抑制EMT；突變H2AX磷酸化位點抑制H2AX磷酸化則部分消除H2AX對EMT的抑制作用。因此，以上結(jié)果充分說明H2AX磷酸化抑制肺癌細胞的EMT，為抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物研發(fā)提供新的靶點分子。至于H2AX磷酸化是否通過誘導肺癌細胞凋亡進而對肺癌EMT的抑制作用產(chǎn)生貢獻值得進一步研究。

目前臨床上治療腫瘤轉(zhuǎn)移的主要靶點為VEGF/VEGFR信號轉(zhuǎn)導通路，如VEGF/VEGFR單抗（bevacizumab等）及VEGFR小分子抑制劑（sunitinib等）［18，22］，但是VEGFR-2基因表達調(diào)控機制不清楚。本實驗首次揭示了表觀遺傳調(diào)控蛋白H2AX與VEGFR-2信號轉(zhuǎn)導通路的關(guān)系。利用siRNA技術(shù)把肺癌A549細胞中的H2AX敲低后，刺激VEGFR-2基因表達；肺癌A549細胞中過表達H2AX則抑制VEGFR-2表達，突變H2AX Ser139磷酸化位點則解除H2AX對VEGFR-2表達的抑制作用。以上結(jié)果首次揭示，H2AX磷酸化確實抑制肺癌A549細胞VEGFR-2水平。本研究采用siRNA技術(shù)驗證肺癌A549細胞內(nèi)VEGFR-2對EMT的調(diào)控作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，敲低VEGFR-2則顯著抑制肺癌A549細胞的EMT，與報道一致。本實驗結(jié)果闡明H2AX磷酸化通過下調(diào)VEGFR-2進而抑制肺癌A549細胞EMT的分子機制。此外，我們還發(fā)現(xiàn)H2AX磷酸化調(diào)節(jié)肺癌細胞中與EMT有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子Slug和β-catenin蛋白。由此看來，H2AX調(diào)控肺癌細胞EMT的作用機制極其復雜，除了調(diào)控VEGFR-2通路外，也參與其他因子的表達調(diào)控。