Regorafenib聯合TAS102新策略治療肝細胞癌的研究

章 俊，董宇華，楊 葉，張夢琪，何 常

1.貴州醫科大學病理學教研室，貴州 貴陽 550004；2.貴州醫科大學附屬醫院病理科，貴州 貴陽 550004；3.貴州醫科大學生理學教研室，貴州 貴陽 550004

瑞格菲尼（regorafenib，REG）是一種新型多靶點酪氨酸激酶抑制劑，是治療原發性肝癌的規范用藥之一［1］。臨床試驗證實其能改善sorafenib治療耐受晚期肝癌患者的生存時間［2］。TAS102是由曲氟尿苷（trifluridine，FTD）及胸苷磷酸化酶抑制劑（tipiracil hydrochloride，TPI）按摩爾濃度2∶1比例制成的一種新型口服配方化療藥物，臨床試驗［3-4］證實TAS102可顯著改善多耐藥性消化道腫瘤的療效，延長患者的生存時間。多項研究［5-9］報道REG或TAS102分別聯合其他化療藥物或靶向藥物能夠有效控制消化道腫瘤的進展。

腫瘤干細胞（cancer stem cell，CSC）決定腫瘤的自我更新及異質性，促進腫瘤的生長、復發、轉移及藥物耐受等，靶向腫瘤干細胞對拮抗腫瘤的演進及治療耐受提供了一條重要途徑［10］。大量研 究［11-12］證實靶向腫瘤干細胞能夠改善腫瘤細胞對抗腫瘤藥物的敏感性，抑制腫瘤生長、復發及轉移。我們報道了靶向氧化應激信號能夠下調肝癌細胞的干細胞性并抑制肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）細胞的增殖［13］。

研究［5］證實序貫給予REG和TAS102能夠有效控制晚期結腸癌的進展。我們報道了FTD類似物5-FU聯合REG顯著改善多耐藥性轉移性結腸癌患者的預后［14］。因此，本研究擬探討REG聯合TAS102靶向CSC治療HCC的療效及潛在機制，以期為臨床治療難治性肝癌提供新的可供選擇的聯合治療策略。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗試劑

生化試劑TAS102（貨號S81525，純度98%）和REG（貨號R843747，純度98%）均購自美國MedKoo Biosciences公司，干細胞培養基購自加拿大Stemcell Technologies公司，CD133-conjugated PE熒光抗體購自英國Abcam公司，乙醛脫氫酶1A（aldehyde dehydrogenase 1A，ALDH1A）及髓細胞白血病-1蛋白（myeloid cell leukemia-1，MCL1）抗體購自美國Cell Signaling Techonology公司，GAPDH和干細胞標志分子SRY相關的高遷移率族盒蛋白-2（SRY-related high mobility group box protein-2，SOX2）抗體購自美國Santa Cruz公司，胎牛血清、青鏈霉素雙抗、DMEM及PRMI-1640培養基均購自美國Invitrogen公司。

1.1.2 實驗細胞

本研究使用的3種人肝癌細胞系HepG2、Huh7及SK-Hep1均購自中國科學院典型培養物保藏委員會昆明細胞庫。HepG2及Huh7均是人HCC細胞株，HepG2來源于兒童肝母細胞瘤，Huh7來源于高分化HCC。二者均表達甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）、未檢出乙肝病毒（hepatitis B virus，HBV）。SK-Hep1來源于肝腺癌患者腹水中的上皮細胞。按照細胞庫推薦的培養基，HepG2、Huh7及SK-Hep1分別培養于含10%胎牛血清及100單位/100 mL青鏈霉素的DMEM或RPMI-1640培養基，并放置于含CO2體積分數為5%、濕度95%的37 ℃培養箱，細胞豐度達80%～90%，進行傳代。

1.1.3 實驗動物

BALB/c雌性4～6周齡裸小鼠購自北京華阜康生物科技股份有限公司，荷瘤成功后飼養于貴州醫科大學實驗動物中心，生產許可證為SYXK（黔）2018-0001。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組

分組分為對照（control）組、REG組、TAS102組和REG+TAS102組。實驗細胞分組見 表1。實驗動物分組見表2。

表1 不同藥物處理的細胞實驗分組Tab.1 Cell experiment grouping with treatment of different regimens

表2 不同藥物處理的動物實驗分組Tab.2 Mouse experiment grouping with treatment of different regimens

1.2.2 細胞計數試劑盒（cell counting kit-8，CCK-8）檢測細胞活力

將4 000個HCC細胞接種到96孔板中，過夜貼壁后加入2 mol/L TAS102 及 5 mol/L REG分別或聯合使用處理48 h。加入10 μL CCK-8試劑溫育2 h，使用酶標儀檢測每孔溶液450 nm處的吸光度（D）值。通過CCK-8［化學名：2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑單鈉鹽］檢測細胞線粒體脫氫酶活性，定量評估細胞活力。

1.2.3 CD133陽性干細胞亞群比例的檢測

不同藥物處理48 h后的HCC細胞，使用偶聯熒光素藻紅蛋白（phycoerythrin，PE）的CD133熒光抗體溫育30 min后，采用流式細胞儀（美國BD公司）檢測CD133陽性細胞的百分比；結果用二維圖示。

1.2.4 肝癌干細胞球（HCC sphere）的培養

按每孔20 000個HCC細胞接種到24孔的低黏附性培養板，使用含不同藥物的腫瘤干細胞培養基體外培養肝癌細胞8 d，觀察孔內HCC sphere的形成及生長，倒置顯微鏡（購自日本Olympus公司）觀察及測量細胞球并對直徑＞60 μm細胞球 計數。

1.2.5 蛋白質印跡法（Western blot）檢測細胞內蛋白水平

收集不同藥物處理后的細胞，使用RIPA緩沖液裂解收集總蛋白，BCA法定量后，按每孔等量12～20 g蛋白上樣于10%～12%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）膠中，置于恒定電壓緩沖系統（XCell system，美國Invitrogen公司）中分離不同相對分子質量蛋白電泳條帶。分離膠中不同相對分子質量蛋白在恒定電流緩沖系統（Bio-Rad，美國Invitrogen公司）轉移到PVDF膜上，使用10%脫脂牛奶封閉后，與一抗4 ℃過夜溫育、相應偶聯辣根過氧化物酶二抗溫育，全自動凝膠成像儀顯示蛋白條帶。Image J軟件測量蛋白條帶的平均光密度值（average optical intensity，AOI）蛋白條帶灰度，與內參蛋白GAPDH AOI比較，計算各種蛋白的相對含量。

1.2.6 動物實驗

本課題設計已通過貴州醫科大學倫理委員會認證，所涉及實驗動物的使用及操作，均嚴格遵循“減少、替代、優化”的3Rs原則。BALB/c裸小鼠皮下每部位接種2×106個細胞，荷瘤成功后使用游標卡尺間隔2～3 d測量瘤體長徑和短徑，按照公式0.5×長×寬2計算瘤體體積并繪制生長曲線，約4周麻醉處死動物，剝離瘤體并稱重。

1.2.7 藥物處理

細胞實驗使用2 mol/L TAS102及5 mol/L REG分別或聯合使用處理3種HCC細胞；動物實驗TAS102溶解于5%羥丙基甲基纖維素配制成終濃度20 mg/mL溶液，4 ℃儲存備用。REG溶解于體積比為42.5%∶42.5%∶15.0%的聚丙二醇/聚乙二醇/聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物188溶液中，配制成終濃度為1 mg/mL溶液，4 ℃儲存備用。TAS102按每日100 mg/kg每日2次灌胃給藥，REG按每日50 mg/kg每日1次灌胃給藥。連續給藥 3周。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 REG和TAS102單藥及聯合使用降低肝癌細胞活力

CCK-8檢測結果發現，REG及TAS102單藥或聯合處理，較對照組均顯著減低了3種肝癌細胞活力（HepG2：Control組為0.491±0.023，TAS102組為0.388±0.013，REG組為0.380±0.022，REG+TAS102組為0.379±0.014；Huh7：Control組為0.738±0.018，TAS102組為0.571±0.011，REG組為0.534±0.015，REG+TAS102組為0.564±0.011；SK-Hep1：Control組為0.696±0.014，TAS102組為0.493±0.034，REG組為0.465±0.047，REG+TAS102組為0.388±0.007）（圖1，P＜0.05）。其中SK-Hep1細胞中聯合用藥較2種單藥處理顯示了增強的細胞活力抑制作用，而在HepG2及Huh7細胞中，聯合用藥沒有顯示顯著增強的聯合抑制效應。

圖1 REG聯合TAS102處理對HCC細胞活力的影響Fig.1 The effect of REG in combination with TAS102 on liver cancer cell viability

2.2 TAS102下調REG誘導增加的CD133陽性（+）細胞亞群比例

CD133是肝癌干細胞（liver cancer stem cell，LCSC）表面重要的標志分子。流式細胞術檢測結果發現，TAS102單藥顯著降低了3種細胞中CD133+細胞亞群比例（HepG2：Control組為53.33%±3.22%，TAS102組為13.11%±2.76%；Huh7：Contro l 組為49.14%±3.32%，TAS102組為18.28%±2.56%；SK-Hep1：Control組為58.73%±4.22%，TAS102組為15.37%±2.76%）（圖2 A、B，P＜0.05）。在HepG2及Huh7細胞中，5 mol/L REG單藥處理顯著提高了CD133+細胞亞群比例（HepG2 REG組為78.19%±4.93%；Huh7 REG組為82.46%±2.28%）（圖2A、B，P＜0.05）。較REG單藥處理，聯合用藥顯著減低了CD133+細胞亞群比例（HepG2 REG+TAS102組為56.32%±2.00%；Huh7 REG+TAS102組為33.28%±2.90%）（圖2A、B，P＜0.05）。在SK-Hep1細胞中，不同用藥組均顯著下調了CD133+細胞亞群比例（SK-Hep1：Control組為58.73%±4.22%，REG組為29.29%±4.28%,TAS102組為15.37%±2.76%，REG+TAS102組為18.48%±3.00%）（圖2A、B，P＜0.05）。

2.3 REG聯合TAS102調控SOX2、ALDH1A及MCL1的表達

本研究結果發現，TAS102單藥處理3 株細胞時，與對照組（SOX2：Huh7 為1.00±0.03，HepG2為0.70±0.05，SK-Hep1為1.71±0.15；ALDH1A：Huh7為1.62±0.03，HepG2為1.40±0.07，SK-Hep1為1.59±0.02）相比，SOX2（Huh7為0.50±0.09，HepG2為0.42±0.11，SK-Hep1為1.15±0.03）及ALDH1A（Huh7為0.72+0.01，HepG2為1.10±0.01，SK-Hep1為0.88±0.02）的蛋白相對表達水平顯著減低（圖3A～C，P＜0.05）。HepG2及Huh7細胞中，REG單藥處理（SOX2：Huh7為1.19±0.04，HepG2為0.78±0.02；ALDH1A：Huh7為1.48+0.03，HepG2為1.62±0.02）與control組相比，對SOX2及ALDH1A的蛋白水平調控作用不明顯或輕度升高（圖3A～C）。聯合用藥較REG單藥處理（SOX2：Huh7為0.54±0.05，HepG2為0.60±0.06；ALDH1A：Huh7為0.60±0.04，HepG2為1.28±0.03）顯著下調了SOX2及ALDH1A的蛋白水平（圖3A～C，P＜0.05）。在SK-Hep1中，不同給藥組均顯著下調SOX2（control組為1.71±0.15，TAS102組為1.15±0.03，REG組為1.25±0.03，REG+TAS102組為0.51+0.02）及ALDH1A（control組為1.59±0.02，TAS102組為0.88±0.02，REG組為1.08±0.02，REG+TAS102組為0.86±0.02）的蛋白水平（圖3 A～C，P＜0.05）。此外，3種細胞中REG單藥處理（Huh7為0.17±0.03，HepG2為0.13±0.00，SK-Hep1為0.35±0.06）較對照（Huh7為0.40±0.02，HepG2為0.35±0.01，SK-Hep1為1.14±0.11）顯著下調了MCL-1水平（圖3A、D，P＜0.05）。在HepG1及Huh7細胞中，TAS102單藥處理較對照組顯著提高了MCL-1水平（圖3A、D，P＜0.05）；而聯合用藥處理（Huh7為0.97±0.05，HepG2為0.47±0.00）較TAS102單藥處理顯著減低了MCL-1的蛋白水平（圖3A、D，P＜0.05）。在SK-Hep1中，TAS102對MCL-1的調控不明顯（control組為1.14±0.11，TAS102組為1.24±0.04）（圖3A、D，P＞0.05）。

圖2 REG聯合TAS102處理對CD133+細胞亞群分布的影響Fig.2 The effect of REG in combination with TAS102 on the subpopulation of CD133 positive cells

圖3 REG聯合TAS102處理對HCC細胞SOX2、ALDH1A和MCL-1蛋白水平的影響Fig.3 The effect of REG in combination with TAS102 on the expression of SOX2,ALDH1A and MCL-1

2.4 REG及TAS102單藥及聯合使用抑制HCC sphere的形成

進一步我們觀察了二者聯合處理8 d對干細胞培養基中生長HCC sphere形成的影響。結果發現，不同用藥組較對照組均顯著抑制了HCC sphere的形成（圖4A、B）。TAS102處理對HCC sphere形成的體積大小影響不大（圖4A），但顯著減少了形成的數量（圖4B，P＜0.05）。REG單藥較TAS102單藥顯著抑制了HCC sphere形成的體積大小及數量（圖4A、B，P＜0.05）。Huh7細胞中，聯合用藥組與兩個單給藥組HCC sphere形成的數量減少，而HepG2及SK-Hep1中，聯合抑制效應不明顯（圖4A、B）。

圖4 REG聯合TAS102對HCC sphere形成的影響Fig.4 The effect of REG in combination with TAS102 on the formation of HCC sphere

2.5 REG聯合TAS102抑制動物體內HCC移植瘤的生長

將SK-Hep1及HepG2分別接種在裸小鼠兩體側，荷瘤成功后按照不同藥物分別治療動物3周。結果發現，不同藥物處理組較對照組均能顯著降低動物體內瘤體的生長；REG單藥較TAS102單藥抑瘤生長顯著；二者的聯合使用較單藥處理進一步抑制了瘤體生長（圖5A、B，P＜0.05）。體內實驗提示TAS102聯合REG較二者單藥治療進一步抑制了動物體內移植瘤的生長。

圖5 REG聯合TAS102對動物體內瘤體生長的影響Fig.5 The effect of REG in combination with TAS102 on tumor growth

3 討 論

REG是一種靶向VEGFR2、VEGFR3、Ret、KIT、PDGFR及RAF等分子的多靶點酪氨酸激酶抑制劑，能夠抑制腫瘤新生血管的生成及細胞增殖。TAS102是治療消化道惡性腫瘤的新型抗瘤藥物。兩者分別協同其他化療藥物及靶向藥物，為臨床治療晚期腫瘤提供了多種有效的聯合新策略。研究［6］發現VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3抑制劑nintedanib聯合TAS102，促進FTD整合入腫瘤DNA分子，貝伐珠單抗靶向抑制腫瘤血管的生成，聯合TAS102顯著改善多耐藥轉移性結腸癌患者的生存率［7］。有研究［14］表明，FTD類似藥物5-FU聯合REG能有效控制多耐藥轉移性結腸癌的進展。本研究發現，TAS102及REG單藥或聯合處理能夠下調肝癌細胞活力。二者的聯合使用亦顯著抑制了HCC sphere的形成。體內實驗進一步證實二者聯合使用能夠顯著抑制動物瘤體的生長，提示REG及TAS102的聯合使用能夠增強抗肝癌治療作用。

CSC是腫瘤細胞的重要亞群。靶向CSC為治愈腫瘤提供了可能的研究途徑。LCSC在無血清懸浮培養的體系中成球生長，較非干性腫瘤細胞，成球細胞的干性標志物的表達顯著升高［15］。研究［12］發現FTD顯著抑制了腫瘤干細胞球的生長，且較腫瘤細胞更為高效地整合入CD44/CD133陽性細胞的DNA分子，抑制了CSC的自我更新及生長。TAS102能夠抑制腫瘤細胞的克隆性生長，并提高了腫瘤細胞對放療的敏感性［11］。而REG或sorafenib處理原代軟組織肉瘤細胞，誘導了ALDH陽性細胞比例升高［16］。本研究發現REG單藥處理顯著上調了CD133+細胞亞群比例及干細胞標志物SOX2和ALDH1A的蛋白水平，聯合使用TAS102較REG單藥處理顯著降低了CD133+細胞比例及干細胞標志物SOX2及ALDH1A的蛋白水平。提示TAS102的聯合使用可能下調了REG單藥治療誘導增強的肝癌干細胞性，從而降低或延緩肝癌細胞對REG單藥治療的耐受。

Sorafenb與REG相似，是一種靶向VEGFR、PDGFR和RAF/MEK/ERK級聯的多靶點酪氨酸激酶抑制劑［17］。研究［18］發現sorafenib能夠下調抗凋亡蛋白MCL-1水平促進HCC細胞的凋亡。細胞內MCL-1蛋白水平決定HCC細胞對sorafenib治療的敏感性，高水平的MCL-1誘導HCC細胞對sorafenib治療的耐受，靶向下調ERK1/2-MCL-1信號促進HCC細胞的凋亡并提高HCC細胞對sorafenib的敏感性［19-20］。我們報道了結腸癌細胞中REG單藥能夠下調FTD類似物5-FU誘導活化的ERK1/2-MCL-1信號，提高藥物的聯合效應及腫瘤細胞對藥物治療的敏感性［14］。本研究發現TAS102上調了細胞內MCL-1的蛋白水平，聯合使用REG能夠下調TAS102誘導升高的MCL-1蛋白水平，提示二者的聯合機制亦涉及HCC細胞中MCL-1信號的調控。

有研究［21］表明，REG能夠抑制腫瘤生長及間質反應，阻斷腫瘤細胞與間質干細胞間的相互促進作用，抑制腫瘤的生長和轉移。之前的研 究［22］證實SK-Hep1細胞系具有類似肝血竇內皮的細胞形態及免疫表型。提示藥物治療在腫瘤實質細胞及間質細胞中的作用及機制不同，體內實驗綜合評估藥物作用是必要的。此外，REG處理48 h及8 d后對CD133陽性細胞亞群比例及肝癌干細胞球的生長調控變化不同，提示藥物治療對腫瘤干細胞性的作用是動態變化的。

本研究證實，REG聯合TAS102能夠提高抗肝癌的療效，其協同作用機制涉及對腫瘤干細胞性及抗凋亡信號的調控。二者的聯合使用為臨床治療難治性HCC提供了一種新的治療策略。