急性心肌梗死患者血清lncRNA GAS5水平與左室重構的相關性

宋士更，韓瑞麗，王一旻，徐杰

（天津市泰達醫院 重癥醫學科，天津300457）

左室重構（left ventricle remodeling,LVR）為心力衰竭發生的重要機制之一。近期研究發現，急性心肌梗死患者發生早期或晚期心室重構后會造成左心室擴張及心功能不全等病理生理現象，嚴重者造成心力衰竭，因此及早診斷、發現LVR對于延緩心力衰竭具有十分重要的臨床意義[1]。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA,lncRNA）屬于長度＞200 nt的非編碼RNA，其水平異常與腫瘤、心血管疾病的發生密切相關[2]。有研究發現，冠狀動脈粥樣硬化性心臟病（以下簡稱冠心病）患者血漿lncRNA GAS5水平低于健康人群，表明其在冠心病預測中具有一定的臨床價值[3]。然而目前與心肌梗死患者LVR的關系尚不清楚。本研究旨在通過檢測急性心肌梗死患者血清lncRNA GAS5水平，探究其與LVR發生的關系，為臨床診斷提供一定的參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年4月—2019年4月在天津市泰達醫院接受治療的169例急性心肌梗死患者作為研究對象，根據是否發生LVR分為LVR組62例與非LVR組107例。其中，男性112例，女性57例；年齡33～79歲，平均（52.45±8.67）歲；ST段抬高型心肌梗死（ST segment elevation myocardial infarction,STEMI）68例，非STEMI 101例。LVR組男性38例，女性24例；年齡35～79歲，平均（53.15±9.24）歲；STEMI 27例，非STEMI 35例。非LVR組男性74例，女性33例；年齡33～76歲，平均（51.13±8.45）歲；STEMI 41例，非STEMI 66例。兩組性別、年齡、心肌梗死類型等一般資料比較，差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。本研究經醫院醫學倫理委員會批準，患者家屬簽署知情同意書。

1.2 納入與排除標準

1.2.1 納入標準①符合美國心臟病學會/美國心臟協會制定的急性心肌梗死評定標準[4]：②臨床表現為缺血性胸痛；③經心電圖檢測發現ST抬高或病理性Q波；④血常規檢測肌酸激酶（creatine kinase,CK）及肌鈣蛋白（cardiac troponin,cTn）含量均是最大正常值的2倍以上；⑤經冠狀動脈造影確診；⑥首次發生急性心肌梗死，發病時間＜24 h；⑦臨床資料完整。

1.2.1 排除標準①自身免疫疾病；②其他器質性心臟病；③呼吸系統疾病、感染疾病及血液疾病；④合并惡性腫瘤、肝腎功能嚴重受損。

1.3 主要儀器及試劑

1.3.1 主要儀器Cobas8000自動生物化學檢測儀（瑞士Roche公司），IE33超聲檢測儀（荷蘭飛利浦公司），NanoDrop2000c核酸測定儀（美國Thermo Fisher Scientific公司），StepOne PlusTM儀（美國Applied Biosystems公司）。

1.3.2 主要試劑RNA提取試劑盒（R6825）（美國Omega公司），逆轉錄試劑盒（RR047A）（美國Thermo Fisher Scientific公司），實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRTPCR）檢測試劑盒（11732020）（日本TaRaKa公司），引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.4 方法

1.4.1 血液樣本采集患者入院后采用抗凝管收集受試者靜脈血5 ml，3 000 r/min離心10 min，分離血清在-80℃儲存備用。

1.4.2 臨床資料收集詳細記錄患者年齡、性別及基礎疾病等情況，收集血液后采用自動生物化學檢測儀檢測血脂水平。

1.4.3 超聲檢測急性心肌梗死患者心室功能患者左側臥位，超聲探頭頻率為3 MHz，將探頭放置在心尖部位，調整探頭使心臟四腔圖像顯示達到最佳狀態，檢測過程中受試者屏住呼吸，采集圖像后在TomTec工作站上分析。于心尖兩腔、三腔及四腔切面上觀察左心室圖像，調整圖像顯示心內膜，在各個切面手動標記心內膜與心外膜，利用軟件自動測量左心室舒張末期容積（left ventricular end-diastole volume,LVEDV）、左心室收縮末期容積（left ventricular end-systole volume,LVESV）及左心室舒張末期心外膜容積（left ventricular end-diastole epicardial volume,LVEDVepi），計算左室射血分數（left ventricular fraction,LVEF）、左室重構指數（left ventricular remodeling index,LVRI），LVRI=1.05×（LVEDVepi-LVEDV）/LVEDV。至少采集3個連續心動周期數據，重復測量3次，求取平均值，以LVESV超過正常上限的15%作為左心室重構評定標準[5]。

1.4.4 qRT-PCR檢測血液lncRNA GAS5采用RNA試劑盒提取血液RNA，于核酸測定儀上檢測RNA濃度及純度，采用逆轉錄試劑盒將RNA逆轉錄為cDNA，30 μl PCR反應體系：2×Green Premix Ex TaqⅡ15 μl，cDNA 2 μl，正反向引物分別為0.8 μl，無核酸酶水11.4 μl。置于StepOne PlusTM儀器上進行qRT-PCR反應，程序參數設定：95℃預變性10 min，95℃變性15 s，60℃退火30 s，共計35個循環，每個樣本設定3次重復。反應結束后，以U6為內部參照，引物序列見表1。采用2-ΔΔCt法分析lncRNA GAS5相對表達量。

表1 qRT-PCR引物序列

1.5 統計學方法

數據分析采用SPSS 22.0統計軟件。計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較用t檢驗；計數資料以構成比或率（%）表示，比較用χ2檢驗；相關性分析用Pearson法；影響因素的分析用多因素Logistic回歸模型；繪制ROC曲線。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組臨床資料比較

兩組年齡、性別、高血壓、糖尿病及總膽固醇（total cholesterol,TC）比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；而兩組甘油三酯（Triglycerides,TG）、LVEDV、LVESV、LVEF及LVRI比較，差異有統計學意義（P＜0.05），LVR組TG、LVEDV及LVESV高于非LVR組（P＜0.05），而LVEF、LVRI低于非LVR組（P＜0.05）。見表2。

表2 兩組臨床資料比較

2.2 兩組血清lncRNA GAS5相對表達量比較

LVR組與非LVR組血清lncRNA GAS5相對表達量分別為（0.65±0.13）和（1.04±0.06），經t檢驗，差異有統計學意義（t=26.569，P=0.000），LVR組較非LVR組低（P＜0.05）。

2.3 急性心肌梗死患者lncRNA GAS5與左心室功能指標的相關性分析

急性心肌梗死患者lncRNA GAS5與LVEDV、LVESV呈負相關（r=-0.324和-0.458，P=0.000和0.001），而與LVEF呈正相關（r=0.376，P=0.000）。見圖1。

圖1 lncRNA GAS5與左心室功能指標的相關性

2.4 急性心肌梗死患者lncRNA GAS5與LVR程度的相關性分析

Pearson相關性分析結果表明，急性心肌梗死患者血清lncRNA GAS5水平與LVR程度呈正相關（r=0.395，P=0.000）。見圖2。

2.5 急性心肌梗死患者發生LVR的多因素Logistic回歸分析結果

以急性心肌梗死患者發生LVR為因變量，將單因素分析中具有統計學意義的因素，如TG、LVEDV、LVESV、LVEF、LVRI及lncRNA GAS5作為自變量，進行多因素Logistic回歸分析。結果顯示，LVEF、LVRI及lncRNA GAS5是急性心肌梗死患者發生LVR的危險因素（P＜0.05）。見表3。

表3 急性心肌梗死患者發生LVR的多因素Logistic回歸分析參數

2.6 lncRNA GAS5對急性心肌梗死患者LVR的診斷價值

lncRNA GAS5在急性心肌梗死患者LVR與非LVR中具有一定的區分能力，lncRNA GAS5診斷急性心肌梗死患者LVR的臨界值為0.812，AUC為0.827（95% CI：0.768，0.891），敏感性為71.56%（95% CI：0.603，0.788），特異性為82.66%（95% CI：0.742，0.923）。見圖3。

圖2 lncRNA GAS5與LVR程度的相關性

圖3 lncRNA GAS5診斷急性心肌梗死患者LVR的ROC曲線

3 討論

心力衰竭為冠心病發展的終末階段，發病率高達2%，而心肌缺血造成的心室重構是引發心力衰竭的主要病因之一[6]。心室重構發生在心力衰竭的各個階段，患者發生心室重構后導致心臟功能受損，出現心室肥厚及心室擴張等代償變化，引發心肌細胞及間質成分等一系列病理改變。因此，早期預測LVR的發生對延緩、終止LVR的進展，提高患者預后十分重要。血清NT-proBNP是LVR常見的預測因子，由于在其他心血管疾病中其水平也會發生異常變化，診斷特異性不高，因此需要尋找新型高效生物學標志物。

急性心肌梗死后心肌梗死區域的擴張會導致左心室舒張及收縮功能不協調，進而影響射血功能，升高左室舒張末壓，進一步造成心室擴張與扭曲[7]。本研究結果表明，LVR組TG、LVEDV及LVESV高于非LVR組，而LVEF、LVRI低于非LVR組；進一步采用多因素Logistic回歸分析，結果表明LVEF、LVRI是急性心肌梗死者發生LVR的危險因素，提示左心室形態功能異常與LVR的發生密切相關。

lncRNA屬于長鏈RNA，長度＞200 nt，不編碼蛋白，其表達水平的異常與多種疾病的發生、發展及預后有關。近期發現lncRNA水平的異常與心血管疾病的發病機制密切有關[8]。lncRNA-MEG3可調控miR-26a/smad1軸，影響動脈粥樣硬化血管平滑肌細胞增殖，參與冠狀動脈疾病的發生[9]。TORAIH等[10]研究發現，冠狀動脈疾病患者外周血lncRNA MIAT升高可能與心血管不良事件發生有關，在不良事件預測中具有一定的臨床價值。以上研究均表明，lncRNA異常表達與心血管疾病的發生密切相關。GAS5屬于lncRNA之一，最初是從小鼠NIH 3T3細胞中分離得到，如今被證實具有抑制腫瘤的作用[11]。ZHANG等[12]研究發現，miR-21可負調控GAS5，參與乳腺癌的發生。過表達GAS5可通過Akt/mtor通路抑制胃癌的發生、發展[13]。WANG等[14]研究發現，lncRNA GAS5啟動子區多態性與結直腸癌風險有關。這些研究均提示lncRNA GAS5蛋白及基因的異常與癌癥的發生密切相關。近期研究發現，GAS5與心肌纖維化的發生有關，可作為miR-21的分子海綿吸附miR-21，調控miR-21對靶基因的抑制[15]。在對動脈粥樣硬化大鼠的研究中發現，lncRNA GAS5是內源性海綿，可直接結合和抑制miR-221的表達，增強巨噬細胞的炎癥反應，加速斑塊的形成[16]。在冠心病大鼠中，lncRNA GAS5過表達可改善大鼠高脂血癥，降低心肌細胞凋亡，減輕氧化應激損傷，抑制心肌組織中Wnt/β-連環蛋白信號通路的異常激活[17]。HAO等[18]通過體外研究發現，GAS5過表達能夠降低心肌細胞凋亡。動物體內實驗發現，過表達lncRNA GAS5能夠降低心肌梗死面積，減輕心肌損傷。這些研究顯示，lncRNA GAS5高表達與心肌損傷恢復有關。本研究結果表明，LVR組lncRNA GAS5表達較非LVR組降低，推測lncRNA GAS5下調可能參與心肌梗死患者LVR的發生過程。lncRNA GAS5與LVEDV、LVESV呈負相關，與LVEF、LVRI呈正相關，表明lncRNA GAS5表達異常可能通過影響心室形態功能進而參與LVR的發生。多因素Logistic回歸分析發現，lncRNA GAS5是急性心肌梗死者發生LVR的危險因素，推測lncRNA GAS5表達降低急性心肌梗死者發生LVR的風險較高。基于LVR組與非LVR組lncRNA GAS5相對表達量有差異，推測其在急性心肌梗死LVR中可能具有一定的預測價值，ROC曲線結果表明，lncRNA GAS5診斷急性心肌梗死患者發生LVR的AUC為0.827，敏感性為71.56%，特異性為82.66%，提示lncRNA GAS5對急性心肌梗死LVR具有一定的診斷價值，可能為其潛在的生物學標志物。

綜上所述，急性心肌梗死患者血清lncRNA GAS5升高與LVR的發生密切相關，是影響急性心肌梗死患者發生LVR的危險因素，且對急性心肌梗死患者LVR的發生具有一定的診斷價值。本研究也存在一定的不足，納入病例數量有限，后期應納入更大樣本量進一步驗證，為臨床診斷LVR提供更充分的依據。