小鼠腦外傷后腦血流的動態變化及其與行為學恢復的相關性

李坤航，張旭東，趙丹，梁宇，鐘詩雨，趙偉東，包義君

（中國醫科大學 1.附屬第四醫院神經外科，沈陽 110032；2.生命科學學院發育細胞生物學教研室，沈陽 110122）

創傷性腦損傷（traumatic brain injury，TBI）是世界范圍內最主要的致死和致殘原因［1］。在中國，每10萬人中有13人因腦損傷而死亡［2］。TBI顯著增加其他神經系統疾病風險，包括慢性創傷性腦病、阿爾茨海默病和抑郁等［3］，從而帶來巨大社會壓力和經濟損失［2］。腦血管損傷是TBI重要的病理生理過程，腦血管結構破壞、功能障礙參與了TBI的發病、發展及損傷修復過程，并與繼發性損傷密切相關。血管功能障礙常表現為腦出血、腦梗死、腦水腫等［4］。腦血流是評估血管功能的重要指標之一，大多數TBI患者在受傷后可以觀察到局部或整體的腦血流減少，進一步導致缺血性腦損傷，這是TBI后死亡的主要原因［5］。但是，關于腦血流的恢復及其與運動功能的相關性研究很少。輕中度腦損傷后，腦血流通常會幾周內恢復正常［4］，早期干預和合理調節腦血流可能會改善TBI患者的預后。

本研究旨在明確TBI后腦血流的動態變化過程，探討腦血流變化與運動功能的相關性，為通過調節腦血流改善TBI患者的預后提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選用84只12 h/12 h光/暗飼養的成年雄性C57BL/6野生型小鼠，體質量25～30 g，12周齡（遼寧長生生物科技有限公司）。所有實驗在中國醫科大學實驗動物管理監督下，符合動物福利和倫理準則。將小鼠隨機分為Sham組和TBI組，每組42只。實驗過程中無小鼠死亡，實驗后給予小鼠安樂死。

1.2 方法

1.2.1 控制性皮質撞擊（controlled cortical impact，CCI）損傷模型建立：采用CCI設備［6］（Pinpoint 精確皮層撞擊器PCI3000，美國Hatteras 公司）構建TBI模型。CCI具有較強的可操作性和較高的準確性，可控制撞擊參數（撞擊速度、撞擊深度和停留時間）以獲得不同程度腦損傷，并通過評估小鼠神經功能和腦損傷深度判定TBI程度。TBI后小鼠神經功能輕度下降而無腦組織結構改變為輕度；TBI后小鼠神經功能明顯下降且腦損傷僅累及皮層未傷及海馬為中度；TBI后小鼠神經功能明顯下降且腦損傷累及海馬或更深層腦組織為重度［7］。

小鼠用異氟烷麻醉后，將其頭部固定在立體定位架中，恒溫加熱墊維持體溫。術區消毒后，在頭皮上做一個長約10 mm的正中切口，剝離皮膚和骨膜，在右頂骨上，以矢狀縫右側和冠狀縫后側3 mm處為中心，用顱鉆鉆開直徑4 mm的圓形骨窗（圖1A）。TBI組小鼠在接受開顱手術后，選擇直徑3 mm的圓形鋼制平頭撞擊器，撞擊器接觸硬腦膜后（圖1B），以1.5 m/s的撞擊速度、1.0 mm的撞擊深度垂直撞擊腦皮層，撞擊后停留50 ms。縫合皮膚，喚醒小鼠。Sham組小鼠只接受開顱手術，不進行撞擊。

1.2.2 激光散斑成像：使用激光散斑血流成像系統［8］（SIM BFI-HR，PRO迅微光電科技有限公司）測量腦血流量。分別于TBI前和TBI后6 h、1 d、3 d、7 d、14 d、35 d對造模成功的小鼠進行激光散斑成像。成像在恒溫麻醉下進行，剪開前期縫合皮膚，暴露顱骨并清洗。在圖像采集過程中，使用無菌棉保持曝光區域清潔干燥。在可見光下調整CCD攝像機焦距以獲得清晰圖像，之后轉換到785 nm激光狀態下采集腦血流信號，用LSCI軟件（SIM BFI軟件，光電科技有限公司）轉換成腦血流圖像。每隔1 s采集1張圖像，共采集20幅圖像。通過LSCI軟件對采集的腦血流圖像進行分析，在小鼠腦左右對稱的固定位置，選取面積50 mm2圓形觀察區域，LSCI軟件自動計算并生成觀察區域平均血流指數（blood flow index，BFI）。通過計算損傷側和損傷對側腦血流的相對變化分析TBI后腦血流的動態改變，腦血流相對變化的計算公式：腦血流相對變化（%）=（損傷側BFI-對側BFI）/對側BFI×100。

1.2.3 轉棒實驗：采用轉棒實驗評估小鼠運動協調性（ZB-200，成都泰盟軟件有限公司）。首先在TBI前第3天開始對小鼠進行轉棒訓練，訓練3 d，每天訓練3次，每次訓練間隔為10 min，轉棒速度為20 r/min，使小鼠在300 s內基本能夠隨轉棒做相應運動，避免在轉棒上失去平衡而掉落。以TBI前第1天跌落時間為基線。然后分別于TBI后第1、3、5、7、10、14、21、28、35天進行實驗，在20 r/min轉棒速度下記錄小鼠跌落時間，未跌落最長實驗時間設為300 s，每次實驗進行3次，間隔10 min，將3次跌落時間均值記錄為每次跌落時間。

1.2.4 懸繩實驗：將小鼠以懸臂狀態放在長30 cm、直徑2 mm的懸繩上，然后被釋放。每只小鼠測試3次，根據缺陷嚴重程度進行評分（0～3分）。小鼠立即從懸繩掉落，記為3分；2只前爪都掛在繩子上，試圖爬到繩子上，記為2分；2只前爪和1只或2只后爪都在繩子周圍，記為1分；4只爪子和尾巴在繩子周圍，有橫向移動，記為0分。

1.2.5 壁架實驗：將小鼠放在高35 cm、寬0.8 cm的籠子壁架上，監測其運動情況。每只小鼠測試3次，根據缺陷嚴重程度進行評分（0～3分）。小鼠從壁架上摔下來或拒絕行走，記為3分；小鼠沒有立即有效地在壁架上行走或從壁架上下來，記為2分；小鼠在壁架上行走時表現出腳部障礙，記為1分；小鼠沿著壁架行走，沒有腳部障礙（即松腳），然后小心翼翼地回到籠子里，記為0分。

1.3 統計學分析

采用GraphPad Prism 7.0軟件進行統計學分析。所有數值均以表示，2組比較采用兩獨立樣本t檢驗，P＜ 0.05為差異有統計學意義。采用SPSS 21.0軟件進行Pearson相關分析和曲線擬合。

2 結果

2.1 小鼠中度TBI模型的構建

TBI造模（圖1A、1B）后，腦組織出現出血和挫裂傷等表現（圖1C）。通過腦組織冠狀切片評估腦損傷區域，確認腦損傷僅局限于皮層未傷及海馬（圖1D），達到中度TBI模型標準。

圖1 構建小鼠中度TBI模型Fig.1 Establishment of a mouse model of moderate traumatic brain injury（TBI）

2.2 TBI后腦血流的動態變化

通過激光散斑技術量化TBI后局部腦血流變化，分別在小鼠腦左右對稱固定位置選取感興趣區域進行數據采集（圖2A）。結果發現，在TBI急性期損傷區域腦血流顯著減少，TBI后6 h、1 d、3 d腦血流分別減少了69.8%、62.9%、67.8%（圖2B、2C）。TBI后3 d腦血流開始恢復，TBI后7 d腦血流雖然有所恢復，但仍減少了45.2%，直至TBI后14 d基本恢復到正常水平（圖2B、2C）。

圖2 TBI后腦血流的動態變化Fig.2 Dynamic changes in cerebral blood flow（CBF）after traumatic brain injury（TBI）

2.3 TBI后小鼠運動行為學的變化

轉棒實驗結果表明，TBI導致運動障礙，TBI后小鼠轉棒時間明顯下降至14.3 s，TBI后3 d下降至最低點13.5 s，之后運動能力逐漸恢復，TBI后5 d、7 d、10 d、14 d、21 d分別為79.6 s、141.4 s、193.8 s、263.0 s、286.0 s，直至TBI后28 d運動協調能力恢復正常（圖3A）。懸繩實驗結果表明，TBI后1 d評分顯著增加，提示前肢肌力明顯受損，TBI后14 d受損肌力大部分恢復。壁架實驗也得到相似結果，TBI后評分顯著增加，提示四肢協調能力下降，并于TBI后14 d基本恢復正常（圖3B）。

圖3 TBI后運動功能的變化Fig.3 Impaired motor function after traumatic brain injury（TBI）

2.4 TBI后腦血流動態恢復與行為學變化的相關性

Pearson相關分析結果表明，TBI后小鼠腦血流動態恢復和行為能力恢復呈顯著正相關（r=0.984，P＜ 0.01）。TBI后當腦血流減少時，小鼠行為能力下降；當腦血流恢復時，小鼠行為能力也逐漸改善（圖4A）。以小鼠轉棒實驗中跌落時間改變量百分比為因變量（Y），以腦血流改變量百分比為自變量（X），繪制散點圖（圖4B），根據圖形趨勢再進行Pearson直線相關分析，發現2組變量呈線性相關（F=124，P=0.000 4）。Pearson直線回歸方程初步建立為Y=1.307X-5.744。

圖4 TBI后腦血流變化和行為能力變化的相關性分析Fig.4 Correlation analysis of cerebral blood flow（CBF）and motor function after traumatic brain injury（TBI）

3 討論

TBI常導致腦血管出現結構損傷，繼而誘發血管痙攣、閉塞等改變，從而影響腦血流，腦血流變化后出現腦缺血、出血、外滲等現象，這些繼發性改變會再次影響腦血流。無論是原發性還是繼發性腦血流變化，都會導致腦損傷，引起神經功能障礙［4，9］。TBI后，腦組織損傷大小、位置、類型以及損傷時間都會影響腦血流變化的形式和程度［9］。HAYWARD等［10］發現，患者遭受中度或重度TBI后，腦血流出現嚴重障礙，隨后緩慢恢復到生理水平。他們還通過灌注加權磁共振成像發現大鼠TBI后6 h同側皮質腦血流減少，隨后24 h腦血流增加，TBI后2～14 d腦血流長期下降。在小鼠TBI模型中也觀察到相似現象。ABRAHAMSON等［11］通過CCI模型發現，小鼠TBI后3周內皮質挫傷區腦血流一直保持低灌注狀態；而丘腦血流在TBI后3 d開始恢復，在TBI后3周基本恢復至正常水平；海馬區血流在TBI后無明顯改變。然而，以往研究無論是在患者還是在動物模型中，均是對幾個孤立時間點的腦血流檢測。而本研究首次持續動態監測小鼠TBI后腦血流變化，即TBI急性期局部腦血流顯著下降，減少了60%～70%，TBI后6 h下降程度最大，減少了69.8%。TBI后3 d腦血流逐漸恢復，TBI后7 d仍呈低灌注狀態，至14 d恢復至正常水平。本研究構建了小鼠腦額葉運動區皮層中度TBI模型，完整記錄TBI后超急性期（TBI后6 h）、急性期（TBI后3 d）、亞急性期（TBI后3周）及恢復期腦血流從減少到恢復的實時動態變化全過程。本研究的連續性血流分析更有利于指導后期腦血流調節治療，為后期臨床應用奠定基礎。

腦血流的平衡與穩定是維持正常神經功能的前提，腦血流改變會引起神經功能障礙。LEISTNER等［12］在對中風兒童的研究中發現，中風患者重要組織中腦血流明顯低于同齡人。與非偏癱患者相比，偏癱患者腦血流灌注不平衡，特別是在運動區。INOUE等［13］發現，重度TBI患者中腦血流恢復好的患者，其神經功能狀態預后要明顯好于腦血流無明顯恢復者。JING等［6］發現，TBI導致小鼠在急性期病變部位腦血流減少，然后逐漸恢復，至TBI后28 d恢復至正常水平，隨后神經認知功能改善。本研究發現，腦血流與運動功能恢復呈顯著正相關。TBI導致小鼠運動協調能力顯著下降，尤其在TBI后3 d最差，與腦血流在TBI后3 d略有下降相對應，隨著腦血流恢復而逐漸改善。本研究發現，當腦血流在TBI后14 d已恢復到正常水平時，運動功能仍存在缺陷，直到TBI后28 d恢復到正常水平，這說明腦血流恢復早于運動功能恢復，提示腦血流恢復是神經功能恢復的前提與保障。本研究首次提出腦血流恢復是運動功能恢復的必要條件，所以早期選擇適當時間點通過高壓氧或藥物等干預因素促進腦血流恢復可能會改善TBI神經功能恢復。

本研究建立的TBI模型模擬的是中等程度的TBI，在其他不同程度（如輕度和重度）的TBI模型中，腦血流和運動功能變化的相關性是否與本研究一致，有待于進一步研究。

綜上所述，TBI可導致腦血流下降和運動功能障礙，隨后腦血流和運動功能逐漸恢復，二者的恢復呈顯著正相關，且腦血流的恢復早于運動功能的恢復。本研究結果表明，臨床工作中可通過TBI患者腦血流恢復情況提早預測運動功能恢復情況；同時，采取措施促進腦血流恢復，可能會促進患者運動功能的恢復。