RhD抗原初檢陰性供血者及患者Del檢測的臨床意義

宋倩，郝一文

（中國醫科大學附屬第一醫院輸血科，沈陽 110001）

目前，我國臨床紅細胞輸血一般要求RhD同型，以避免發生D抗原不同導致的免疫問題。RhD陰性比例極低，是大眾熟知的“熊貓血型”。RhD基因具有豐富多態性，我國中部地區初檢RhD陰性者中約20%～30%為Del型，即極弱D或放散D［1-5］。Del型自身存在D抗原，Del型受血者或孕婦輸血時不會被D抗原致敏而產生D抗體［6-7］，因此不必輸注RhD陰性血而浪費RhD陰性血資源；而Del型供者則可能因攜帶的少量D抗原使RhD陰性者產生免疫反應，使RhD陰性者產生抗D抗體而使后續輸血困難。因此，對RhD陰性患者、孕婦及供者進行Del篩查具有重要意義。本研究對我科室2018年9月至2019年8月間112例初檢RhD陰性者進行Del篩查，探討Del檢測的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

收集2018年9月至2019年8月中國醫科大學附屬第一醫院輸血科接收的初檢RhD陰性標本112例，其中內科輸血17例，外科手術備血31例，產科住院者產前備自體血9例，門診孕婦產前抗體效價檢測6例，供血者49例（血液規格2 U/例）。

1.2 試劑及儀器設備

單克隆抗D（IgM+IgG）購自長春博德生物技術有限責任公司，單克隆抗D（IgG）定型血清購自上海血液生物醫藥有限公司。ABO-CDE血型定型卡及Coombs微柱凝膠卡購自西班牙Diana公司。單克隆抗c、抗e血型定型試劑，抗人球蛋白試劑和不規則抗體篩查細胞購自上海血液生物醫藥有限公司。O型RhD陽性壓積紅細胞由本實驗室配制并當日使用。

1.3 方法

1.3.1 常規Rh血型檢測：采用ABO-CDE微柱凝膠定型卡檢測患者血標本ABO-CDE血型表型；采用鹽水法IgM型抗c、抗e檢測c、e表型，具體步驟均按照說明書進行操作。

1.3.2 直接抗人球蛋白試驗（direct antiglobulin test，DAT）：為排除紅細胞直抗陽性對檢測結果的干擾，每例紅細胞標本均進行DAT。具體方法按說明書操作。

1.3.3 Del型檢測：利用3批次不同細胞株來源的抗D對初篩RhD抗原陰性、直抗陰性標本進行試管法間接抗人球蛋白試驗（indirect antiglobulin test，IAT），排除弱D后進行吸收放散實驗：（1）將待測壓積紅細胞和O型RhD陽性紅細胞分別與單克隆抗D（IgM+IgG）1 ∶1混勻，各實驗管均置37 ℃孵育30 min；（2）生理鹽水反復洗滌，直至取末次洗滌液與5% O型RhD陽性細胞IAT反應陰性；（3）加入等體積生理鹽水，置56 ℃放散10 min，離心1 min；（4）取放散液100 μL加入5%的O型RhD陽性紅細胞懸液50 μL，37 ℃孵育30 min；（5）洗滌3次，加抗人球蛋白試劑，離心15 s，肉眼或顯微鏡下觀察結果。

1.3.4 臨床輸血不良反應及輸血相關免疫性抗體發生情況監測：查閱48例受血者（內科輸血17例，外科手術備血31例）輸血記錄和住院病志，并在患者輸血后1～7 d抽取1次靜脈血進行卡式不規則抗體篩查，具體步驟按說明書進行操作。本研究取得受血者知情同意并簽署知情同意書。

2 結果

2.1 初檢RhD陰性者DAT、IAT及Del型分布結果

結果顯示，112例初檢RhD陰性者DAT和IAT均陰性。初檢RhD陰性者Del型分布見表1。

表1 112例初檢RhD陰性者Del型分布

2.2 初檢RhD陰性者的RhCE表型分布

結果顯示，35例Del型中，RhCE表型Ccee19例、CCee 11例、CcEe 2例、CCEe1例、ccEe2例，見表2。

表2 RhCE表型分布 ［n（%）］

2.3 孕婦臨床處置

9例Rh陰性住院自體貯血孕婦中4例（含1例Del型）各采集1次全血（400 mL），5例（含3例Del型）各采集2次全血（共800 mL），在分娩中和分娩后均未回輸，血液過期報廢處理。6例門診Rh陰性孕婦（含2例Del型）孕24～32周時進行2次或3次產前抗體效價檢測，均未檢出Rh系統抗體，其中1例Del型孕婦預防注射了抗D免疫球蛋白。

2.4 初篩RhD陰性受血者血液供應、輸血不良反應及相關免疫性抗體發生情況

結果顯示，48例RhD陰性受血者（內科輸血17例，外科手術備血31例）從提交輸血申請單到RhD陰性血液送達醫院輸血科時間為0.5～3 d，平均1.2 d。其中4例外科手術備血、1例內科輸血患者因RhD陰性血存量有限降低了申請劑量。

12例RhD真陰性患者（內科11例，外科1例）輸注了Del型血，其中1例內科患者接受了2次Del型紅細胞（4 U），其余受血者均接受1次Del型紅細胞（2 U）。受血者輸血情況見表3。另外，外科中19例患者（含6例Del型，13例真陰性）手術過程失血量少、無乏氧狀態，故未輸血。48例RhD陰性受血者均未見輸血不良反應，均未產生抗D抗體。

表3 48例RhD陰性受血者輸血情況

3 討論

Del型在歐洲、美洲及南亞地區少見，RhD陰性人群中概率＜1%［8-10］，但在東亞地區RhD陰性人群中常見（9.1%～26.9%）［11-13］。我國Del表型常由RhD等位基因突變引起，RhD基因的第9外顯子1 227位發生G＞A堿基突變，此等位基因堿基突變為無義突變，但是影響mRNA正常拼接，使RhD基因表達正常Rh（D）蛋白的效率降低［6，14］。正常RhD抗原陽性紅細胞表面約有10 000～30 000個抗原表位，而Del型紅細胞膜上D抗原非常弱，表位數量可能＜30個［15］，只有通過吸收放散試驗才能檢測出來。莊乃保等［7］通過Del型與RhD蛋白質三維結構比較，發現Del型膜外部分與正常RhD蛋白基本一致，即Del血型完全或基本具有正常RhD的抗原表位。因此，在輸血相容性檢測中確認RhD陰性供血者時排除Del型對確保輸血安全非常重要，同時，Del受血者則無需等待RhD陰性血液，有助于提高診療效率，節約稀有血型的血液資源。

本研究中112例初檢RhD陰性標本中Del型35例（31.3%），與西安（19.7%）［3］、武漢（24.2%）［4］、合肥（27.2%）［5］比較概率較高。孕婦中RhD陰性者是孕期產生RhD抗體的高風險群體。吳筱瑩等［16］研究發現，196例初檢陰性孕婦中，Del型占20.9%，去除Del型樣本重新統計，有生育史的RhD真陰性孕婦發生D抗原同種免疫反應者接近50%；研究還發現Del型孕婦不因妊娠和生育產生抗D抗體。本研究中2例（33.3%）Del型孕婦在門診期間接受了包括產前不規則抗體篩查及產前RhD抗體效價測定、RhD免疫球蛋白預防應用等處置。4例（44.4%）Del型孕婦在孕晚期采集了400～800 mL自體血。可見，未進行Del檢測使Del型孕婦承擔更多的醫療負擔，而RhD真陰性孕婦胎兒溶血發生概率被低估。

有研究［17］報道Del供血輸注給RhD陰性患者產生抗D抗體。本研究中獻血者15例Del型供者中13例輸注給了真陰性患者。12例受血者中有1例接受了2次Del型紅細胞（4 U），11例接受1次Del型紅細胞（2 U），所有患者住院期間均無輸血反應報告（受血者輸血前均未檢出不規則抗體），對受血者不規則抗體監測時間最長1周，血清中均未檢出抗D抗體，這可能與患者輸血量和輸血次數有關。Del細胞表面D抗原數量較D陽性細胞少，患者初次抗原免疫刺激后機體約60～90 d后產生抗體，初次免疫產生抗體后再次被相應抗原刺激免疫記憶反應的抗體效價在2～3周達到峰值。另外，我國RhD陰性者基因結構有完全缺失、部分缺失和不缺失3種，RhD基因不缺失者輸入Del紅細胞不會產生抗D抗體［17］。

有研究［18］表明Del型與RhCE表型相關，Del型中100%RhC（+）。本研究35例Del型中RhCE表型為Ccee19例、CCee11例、CcEe 2例、CCEe1例、ccEe 2例，RhC陽性較多（94.3%），但仍有2例為RhC陰性，說明臨床應用中根據CE表型直接排除Del型不可行。研究［2，13］顯示，隨著更多Del相關等位基因被發現，其對應的血清學表型不具唯一性。另外，吸收放散試驗存在一定缺陷：（1）操作過程繁瑣費時，人員操作誤差較大；（2）Del型紅細胞表面存在抗原量極少，反應強度弱容易被忽略而漏檢。

綜上所述，初檢RhD陰性人中Del型比例較高，應對初檢RhD陰性者進行Del型檢測，避免RhD陰性患者輸注Del血液而產生抗D抗體；如果患者為Del型，可以選擇RhD陽性血液輸注，既能保證輸血的及時性，又能節約寶貴的RhD陰性血液資源。僅憑RhCE表型不能排除Del型，血清學聯合分子生物學方法有利于檢測標準化，提高檢測準確度［12，19］。