通過分析ki67 與肝癌患者體外藥敏實驗的關系預測臨床用藥

趙魚扉，史政榮

（重慶醫科大學附屬第一醫院 肝膽外科，重慶）

0 引言

原發性肝癌是全球致死率第三的惡性腫瘤，在亞洲地區大多因乙型肝炎病毒感染導致，其好發于中年人群，且男性發病率更高[1]。原發性肝癌病因尚未明確，而肝硬化、肝炎病毒復制活躍被認為與其發病相關，且大多數肝癌早期患者臨床癥狀不典型，常常錯過了最佳診療時機[2]。ki67 是一種反應細胞增殖活躍程度的相關抗原，有研究表明在惡性腫瘤患者中，其表達率越高，預后越差[3]。有研究表明ki67 在肝癌患者中的表達水平能一定程度上預測肝細胞癌（HCC）的術后復發[4]。高通量藥物敏感性篩選是一種確定藥物敏感性的新方法，具有藥物覆蓋范圍廣、效率高和個性化強的優點。與其他藥物敏感性篩選方法相比，它具有經濟、檢測迅速、易于推廣的優點[5]。本項研究通過使用高通量藥物敏感性篩選來鑒定個體患者的HCC 細胞敏感藥物，再比較這些藥物在ki67 高表達組與低表達組中對腫瘤細胞的抑制率，根據其結果在一定程度上指導臨床用藥。目前國內外關于ki67 與體外藥敏實驗的研究甚少，本課題組之前已經證明了體外高通量藥敏實驗能在一定程度上指導臨床用藥，本次實驗擬評估其與免疫組化指標ki67 之間的關系，也在一定程度上指導臨床用藥[6]。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2013 年1 月至2017 年6 月于重慶醫科大學附屬第一醫院肝膽外科接受根治性腫瘤切除術的64 例肝癌患者，手術過程中取病灶組織進行高通量藥敏實驗，并使用免疫組織化學法測定各標本ki67 表達率，將ki67 高表達（ki67＞25%）的患者設為觀察組，將ki67 低表達（ki67＜25%）的設為對照組。共64 例肝癌患者，其中ki67 高表達組患者36 例，ki67低表達組患者28 例，各組臨床資料比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。納入研究的所有患者術前均顯示HCC，術中腫瘤完全切除，術后經病理檢查發現HCC，膽管癌或混合細胞癌，并具有特定的免疫組化結果。所有患者均提供書面知情同意書，該研究得到重慶醫科大學附屬第一醫院倫理委員會的批準（第2019-021 號），并符合1975 年修訂的《赫爾辛基宣言》倫理準則。已在中國臨床試驗中心（https://www.chictr.org.cn）注冊，注冊號為ChiCTR1900022193。

1.2 方法

所有肝癌患者標本均運輸并保存在4 ℃下。通過用消化酶消化獲得原代癌細胞。在體外擴增癌細胞后將細胞懸浮液（10 μL）加入RPMI 1640 培養基（80 μL）中并與臺盼藍染料充分混合。然后將混合物的等分試樣（10 μL）放在血細胞計數板上，對四個大正方形中的細胞總數進行計數。細胞濃度（細胞數/1 mL 細胞懸液）的計算公式為：4 個大方塊中的細胞總數/4×104×10（稀釋倍數）。通過比較死細胞（染色為藍色）和活細胞（未染色）的數量來評估原代細胞的生存能力。為了評估藥物敏感性，將原代癌細胞接種到臨床藥物篩選板上，用臨床實踐中使用的藥物（單一療法或聯合療法，共14 種藥物）進行治療。其中單一藥物有表柔比星、氟尿嘧啶、索拉非尼等，藥物組合的例子是阿霉素+奧沙利鉑和吉西他賓+奧沙利鉑。這些濃度是臨床實踐中使用的濃度，符合國際藥物標準。將抑制率＞40%的結果設置為藥物有效。

1.3 統計學方法

應用SPSS 22.0 軟件進行統計學分析。計數資料行χ2檢驗，采用率（%）表示，計量資料行t檢驗，采用均數± 標準差（）表示，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 使用單藥如表柔比星、氟尿嘧啶等在ki67 不同表達組中的比較

在體外藥敏實驗中使用表柔比星、氟尿嘧啶等單一藥物，ki67 高表達組與低表達組在腫瘤增殖抑制率上差異無統計學意義（P＞0.05），詳見表1、表2。

表1 表柔比星在ki67 不同表達組中的比較[n(%)]

表2 氟尿嘧啶在ki67 不同表達組中的比較[n(%)]

2.2 聯合用藥如吉西他賓+奧沙利鉑等在ki67 不同表達組中的比較

在體外藥敏實驗中使用吉西他賓+奧沙利鉑聯合用藥，ki67 高表達組與低表達組在腫瘤增殖抑制率上差異無統計學意義（P＞0.05），詳見表3。

表3 吉西他賓+奧沙利鉑在ki67 不同表達組中的比較[n(%)]

2.3 使用阿霉素+奧沙利鉑在ki67 不同表達組中的比較

在體外藥敏實驗中使用阿霉素+奧沙利鉑聯合用藥，ki67 高表達組中陽性率明顯高于ki67 低表達組，差異有統計學意義（P＜0.05），詳見表4。

表4 阿霉素+奧沙利鉑在ki67 不同表達組中的比較[n(%)]

3 討論

在本項研究中，我們通過體外高通量藥物敏感性來評估，對于個體患者的腫瘤細胞，哪些藥物能有效抑制其增殖[7-8]。再通過統計學方法，分析ki67 表達不同的患者與體外高通量藥敏實驗結果的關系，得出結論：在ki67 高表達肝癌患者的體外藥敏實驗中，使用阿霉素+奧沙利鉑能明顯抑制腫瘤細胞的增殖。由于本科研組已在之前研究中證明了，體外高通量藥敏實驗能在一定程度上指導臨床用藥[9-10]。所以本次研究的結果，我們認為也能在一定程度上指導臨床用藥，即術后病檢提示ki67 高表達的肝癌患者，使用阿霉素+奧沙利鉑聯合用藥，更有利于患者預后。

細胞核ki67 蛋白與細胞增殖有關，其在G2/M 期高表達。而阿霉素等化療藥物的藥理作用為進入細胞核內干擾轉錄過程，阻止mRNA 的合成，在細胞分裂的G2 期阻斷細胞周期及抑制腫瘤生長，筆者推測，這可能是ki67 高表達患者使用阿霉素+奧沙利鉑聯合用藥后腫瘤細胞抑制更有效的原因[11]。本研究為單中心、小樣本的研究，存在一定的局限性，且此次研究僅為體外藥敏實驗與免疫組化間的對照，并未結合患者在臨床上的復發及總體生存率，一項多中心的、前瞻性的臨床研究是下一步研究的方向。