基于網絡藥理學探討知母皂苷A-Ⅲ抗鼻咽癌的作用機制

成南南 徐 寧 楊萌哲 白先愚 郭興喆 楊建宇 呂安喬 黃元姣，▲

1.廣西醫科大學生物分子醫學研究實驗室，廣西南寧 530021；2.廣西醫科大學生命科學研究院，廣西南寧 530021

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）是我國高發的頭頸部惡性腫瘤之一，其發病率和死亡率均高于全球平均水平[1]，研究發現中藥治療NPC可起到緩解癥狀、減毒增效和提高患者生存質量的作用[2]。中藥知母具有抗菌、抗腫瘤、解熱和抗炎等多種藥理活性[3]，知母皂苷A-Ⅲ是其藥理活性最主要的成分。近年來，研究發現知母皂苷A-Ⅲ對多種腫瘤細胞均有良好的抑制作用[4-5]，推測其為良好的抗癌中藥，但目前對NPC尚未有研究。因此，本研究借助網絡藥理學，深入挖掘知母皂苷A-Ⅲ抗NPC的潛在靶點和作用機制，以期為知母皂苷A-Ⅲ的進一步研究提供方向，為臨床用藥提供循證依據。

1 資料與方法

1.1 知母皂苷A-Ⅲ的靶點預測

通過Swiss Target Prediction數據庫獲取知母皂苷A-Ⅲ靶點蛋白，并消除重復和不規范的命名，標準化命名。

1.2 NPC相關疾病靶點的獲取和交集靶點的確定

利用GeneCards數據庫檢索NPC疾病相關基因，通過Venny平臺將知母皂苷A-Ⅲ的預測靶點與NPC的相關疾病靶點相互映射取交集，獲得知母皂苷A-Ⅲ抗NPC作用靶點。

1.3 知母皂苷A-Ⅲ與NPC相關靶點的蛋白互作網絡構建

將Venny圖獲取的交集靶點輸入STRING數據庫進行可視化分析，最終獲得知母皂苷A-Ⅲ與NPC相關靶點蛋白質相互作用網絡圖。

1.4 GO（基因本體）和KEGG（京都基因與基因組百科全書）相關靶點通路分析及網絡構建

將1.2獲取的知母皂苷A-Ⅲ抗NPC作用靶點輸入DAVID數據庫進行GO功能注釋和KEGG通路富集分析，并整合化合物、通路和靶點蛋白繪制“化合物-關鍵靶點-通路-疾病”網絡圖。

2 結果

2.1 知母皂苷A-Ⅲ的靶點預測

通過Swiss Target Prediction數據庫獲取知母皂苷A-Ⅲ所有靶點，規范化后獲得81個潛在靶點。

2.2 NPC相關疾病靶點的獲取和交集靶點的確定

在GeneCards數據庫獲取NPC疾病相關基因1758個，與知母皂苷A-Ⅲ的預測靶點相互映射，通過Venny平臺取交集，獲得知母皂苷A-Ⅲ抗NPC作用交集靶點31個，見圖1。

圖1 知母皂苷A-Ⅲ與NPC相關靶點韋恩圖

2.3 知母皂苷A-Ⅲ與NPC相關靶點蛋白質互作網絡（PPI）的構建

該網絡包含30個節點（Nodes）和116條邊（Edges），該圓形節點代表知母皂苷A-Ⅲ抗NPC的相關靶點蛋白，其按度值（Degree）逆時針排列，邊代表不同靶點蛋白的相互作用關系，見圖2。

圖2 蛋白質相互作用（PPI）網絡圖

2.4 GO功能注釋

GO功能富集分析結果顯示，生物過程（biological process，BP）55條，主要涉及藥物反應、基因表達、轉錄調控、細胞增殖和凋亡過程等方面；細胞組成（cellular component，CC）10條，涉及細胞膜、核漿和膜筏等方面；分子功能（molecular function，MF）13條，涉及藥物結合、蛋白質結合、酶結合和酶活性等方面；依據P＜0.01，按照P值升序排列結果前15條顯著富集的條目，見圖3。

圖3 知母皂苷A-Ⅲ抗NPC GO功能注釋

2.5 KEGG通路富集分析

KEGG通路富集分析結果顯示，顯著富集的通路是蛋白多糖通路（proteoglycans in cancer）、癌癥信號通路（pathways in cancer）、PI3K-Akt信號通路（PI3K-Akt signaling pathway）、HIF-1信號通路（HIF-1 signaling pathway）、Rap1信號通路（Rap1 signaling pathway）和病毒致癌通路（viral carcinogenesis）等12條通路。見圖4。

圖4 知母皂苷A-Ⅲ抗NPC KEGG通路富集分析

2.6 “化合物-關鍵靶點-通路-疾病”網絡圖的構建

該網絡包含91個節點（nodes）和374條邊（edges），其中圓形節點代表關鍵靶點，正三角形節點代表通路，見圖5。

圖5 “知母皂苷A-Ⅲ-靶點-通路-疾病”網絡圖

3 討論

NPC與多種危險因素相關，包括人類皰疹病毒（EB病毒）感染、遺傳因素和環境因素[6]。我國NPC發病率居全球首位，年發病率約為每10萬人30例[7]，NPC放療后復發、轉移和嚴重并發癥等問題丞待解決。目前，常用順鉑等常規化療藥治療，但其有多種嚴重副作用，近年來，中醫藥在防治腫瘤上備受關注。現代藥理研究表明知母具有抗病原微生物、抗腫瘤和抗衰老等作用，知母皂苷A-Ⅲ是其藥理活性最主要的成分。本研究基于網絡藥理學多靶點、多通路的研究思路，構建知母皂苷A-Ⅲ抗NPC的作用網絡，預測關鍵靶點和通路，從而推測知母皂苷A-Ⅲ抗NPC作用機制。

通過對“知母皂苷A-Ⅲ-靶點-通路-疾病”網絡圖分析，發現蛋白激酶C（PRKCA）、胰島素樣生長因子1受體（IGF1R）和血管內皮生長因子A（VEGFA）是網絡中的關鍵靶點，PRKCA是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，發現在肺癌[8]，經膠質神經瘤[9]，非小細胞肺癌細胞系[10]中上調，調節細胞增殖、侵襲和遷移等生物學行為。IGF1R通過引發Ras/Raf/MAPK（膜受體酪氨酸蛋白激酶信號傳遞途徑）和磷脂酰肌醇激酶（PI3K）等信號級聯反應參與癌細胞的增殖、凋亡、分化和惡性轉化等調控[11]，研究顯示NPC C666-1細胞系中IGF1R高度上調[12]，促進細胞的侵襲和增殖能力。同時，靶向抑制IGF1R可以阻滯細胞周期和誘導凋亡抑制NPC細胞增殖，并且可以使NPC細胞放射敏感性增高[13]。血管內皮生長因子（VEGF）誘導的基質金屬蛋白酶（MMPs）不僅通過降解內皮細胞外基質而參與新血管的形成，而且還調節癌癥的侵襲和轉移，從而導致NPC的發生發展[14-15]。Chen等[16]發現抑制VEGFA表達水平可以抑制NPC CNE2細胞系侵襲能力并增強NPC放射敏感性。因此推測，知母皂苷A-Ⅲ可能通過單獨或共同調節PRKCA、IGF1R和VEGFA，抑制NPC的增殖、分化、侵襲遷移和放療增敏達到抗NPC的目的。

GO結果表明，知母皂苷A-Ⅲ是通過藥物結合、蛋白質結合等作用于細胞膜、核漿和膜筏等部位調控基因表達、轉錄調控、細胞增殖和凋亡過程，預示知母皂苷A-Ⅲ通過調控上述生物過程抑制NPC的發生和發展。KEGG結果顯示PI3K-Akt（磷脂酰肌醇激酶-絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶）通路顯著性較高，其異常激活與NPC的發生發展密切相關，研究表明，miR-155通過激活PI3K-Akt，促進NPC CNE2細胞的增殖和侵襲[17]，雷公藤甲素通過抑制PI3K-Akt上調半胱天冬酶3剪切帶（cleavedcaspase-3）和凋亡調節蛋白（Bax），下調Bcl-2抑制NPC C666-1細胞增殖并誘導其凋亡[18]，野鴉椿酸可通過抑制哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（PI3K-AKTmTOR）上調Bax和caspase-3，下調凋亡調節蛋白（Bcl-2）和周期蛋白-D1（cyclin D1）阻滯細胞周期在G1/ S期并誘導NPC細胞凋亡[19]。本研究結果表明，知母皂苷A-Ⅲ可能通過調節PI3K-AKT信號通路抗NPC。

目前NPC化療藥物順鉑常伴有肝腎毒性、骨髓抑制和嚴重的胃腸道反應，PI3K-Akt信號通路抑制劑LY294002以時間依賴性方式對正常細胞顯示毒性[20]，因此也不能成為NPC患者的臨床用藥。知母作為我國的傳統中藥歷史悠久，《中華人民共和國藥典》記載知母具有清熱瀉火、生津潤燥的功效，知母皂苷A-Ⅲ是知母的主要成分，綜上所述，本研究基于網絡藥理學的分析方法，揭示知母皂苷A-Ⅲ抗NPC是一個涉及多靶點、多通路的共同作用過程，推測知母皂苷A-Ⅲ可通過PRKCA、IGF1R和VEGFA等多個核心靶點及蛋白多糖癌癥通路、癌癥信號通路和PI3K-Akt信號通路干預NPC的發生發展，提示其可能起到緩解癥狀、減毒增效和提高患者生存質量的作用，可作為NPC患者治療干預的良好中藥。

本研究也存在不足，中藥單體是多靶點、多通路綜合作用的結果，由于數據庫不完善以及計算機無法真實模擬體內環境，因此本研究著重于理論分析，后期仍需要更多動物實驗臨床驗證，但這為后續實驗提供理論依據，指明研究方向。