腦膠質瘤患者異檸檬酸脫氫酶（IDH）1/2基因突變與O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉移酶（MGMT）基因啟動子區甲基化的相關性研究

林華亮 鄭澤洲 鄭偉杰

1.廣東省汕頭市龍湖區第二人民醫院急診外科，廣東汕頭 515041；2.廣東省汕頭市中心醫院神經外二科，廣東汕頭515100；3.廣東省汕頭潮南民生醫院神經外科，廣東汕頭 515144

腦膠質瘤屬于中樞神經系統比較常見的惡性腫瘤，但是WHO規定，Ⅰ級腦膠質瘤通過手術完全切除治愈，絕大部分Ⅱ～Ⅳ級腦膠質瘤會經常性復發，增加了患者的生活壓力[1-2]。隨著醫學的不斷發展，很多疾病的治愈效率明顯提高，但是對于腦膠質瘤的研究表明[3-4]，其生存時間沒有得到根本性改善。隨著腦膠質瘤WHO經典組織學分級方案的制訂，越來越多的研究表明分子遺傳學的分類方案和患者預后有著密切的關系[5-6]。目前最新的膠質瘤分類，將經典組織學分級和分子遺傳學的分類進行結合，從而對膠質瘤進行綜合性的研判。有研究表明[7-8]，2008年，異檸檬酸脫氫酶（IDH）1/2基因在膠質瘤患者全基因組測序中被發現，其和腦膠質瘤有著密切的關系，同時IDH 1/2突變和患者的生存時間也有一定的關聯性。本研究通過分析汕頭市龍湖區第二人民醫院普外科2018年1月至2020年2月腦膠質瘤患者60例臨床資料進行分析，擬探討腦膠質瘤患者IDH1/2基因突變與O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉移酶（MGMT）基因啟動子區甲基化的相關性，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取汕頭市龍湖區第二人民醫院普外科2018年1月至2020年2月腦膠質瘤患者60例臨床資料進行分析，其中男40例，女20例，年齡4～77歲，平均（40.3±15.2）歲。按照中樞神經系統組織學分類，Ⅰ級3例，毛細胞型星形膠質細胞瘤3例，Ⅱ級12例，少突星形細胞瘤3例、彌漫星形細胞瘤4例、星形細胞瘤1例、少突膠質細胞瘤4例，Ⅲ級15例，間變星形細胞瘤9例、間變少突膠質細胞瘤6例，Ⅳ級30例，膠質肉瘤5例、多形性膠質母細胞瘤25例。納入標準：①患者生存質量評分＞60分；②通過手術和組織病理學證實結果為惡性腦膠質瘤；③患者血紅蛋白≥100 g/L。排除標準：①心臟、肝、肺和腎臟重要臟器功能異常患者；②身體和其他臟器腫瘤患者；③接受放化療或免疫性治療患者；④嚴重性過敏患者。

1.2 方法

1.2.1 IDH 1/2基因突變的檢測方法 對IDH 1/2基因突變進行測序。首先通過患者腫瘤標本組織進行DNA提取，采用紫外分光光度計（SHIMADZU/島津）觀察DNA是否符合要求，對合格的DNA進行擴增，瓊脂糖凝膠電泳法觀察擴增基因。去除擴增產物中的雜質，如脫氧核糖核苷三磷酸、引物二聚體、蛋白質和無機鹽等，然后在將PCR產物作為模板，以脫氧核糖核苷三磷酸和雙脫氧核苷三磷酸作為底物進行熒光標記，完成線性擴增，形成了僅差1個堿基對的部分片段混合物，通過去除雜志，純化PCR產物，高溫讓雙鏈DNA變性，采用毛細管電泳，觀察結果，進行待測模板序列的判讀。

1.2.2 MGMT基因啟動子區甲基化的檢測 通過甲基化特異性PCR（MSP）法進行檢測，首先將腫瘤標本組織進行DNA提取，采用紫外分光光度計觀察DNA是否符合要求，通過亞硫酸鹽對DNA進行甲基化修飾，PCR擴增特異性引物，凝膠電泳檢測MSP的產物，凝膠成像系統觀察結果。

1.3 觀察指標及評價標準

①觀察腦膠質瘤患者IDH 1/2基因突變與MGMT基因啟動子區甲基化情況。甲基化判定標準[9-10]：甲基化的特異性引物出現擴增條帶，但是非甲基化引物沒有擴增條帶，兩種特異性引物均有擴增條帶出現。②觀察IDH 1/2基因突變與MGMT基因啟動子區甲基化相關性分析情況。

1.4 統計學分析

采用統計學軟件SPSS 23.0建立數據庫，針對計數資料通過百分率（%）表示，采用χ2檢驗分析，相關性分析通過Spearman相關性分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 腦膠質瘤患者IDH 1/2基因突變與MGMT基因啟動子區甲基化情況

18例檢測出IDH 1/2基因突變，其中WHO的分級Ⅱ級8例、Ⅲ級7例，Ⅳ級3例，分級在IDH 1/2基因突變分布中，差異有統計學意義（χ2=108.454，P=0.000），33例檢測出MGMT基因啟動子區甲基化，其中WHO的分級Ⅰ級2例、Ⅱ級8例、Ⅲ級8例，Ⅳ級15例，分級在MGMT基因啟動子區甲基化分布中，差異無統計學意義（χ2=0.527，P=0.538）。見表1。

2.2 IDH 1/2基因突變與MGMT基因啟動子區甲基化相關性分析情況

IDH 1/2基因突變與MGMT基因啟動子區甲基化呈明顯正相關，差異有統計學意義（r=0.368，P=0.014）。

3 討論

IDH 1/2基因處于人體染色體2q33，3上的IDH 1/2基因基因編碼，屬于三羧酸循環限速酶的一種，參與細胞能量代謝[11-12]。有資料顯示[13-14]，組織學分級相同的腦膠質瘤患者，IDH 1/2基因突變型高于野生型的預后，說明IDH 1/2基因突變和腦膠質瘤預后預測有一定的關系。本研究中，18例檢測出IDH 1/2基因突變，其中WHO的分級Ⅱ級8例、Ⅲ級7例，Ⅳ級3例，分級在IDH 1/2基因突變分布中，差異有統計學意義，需要將形態組織學和基因分型密切的結合，才可以更加準確判定腦膠質瘤的預后水平[15-16]。MGMT屬于DNA修復蛋白的一種，對其編碼的基因處于染色體10q26。有資料顯示，放療聯合化療的患者，MGMT基因啟動子區甲基化的生存率較高，同時MGMT甲基化在烷化劑化療中更加敏感，在腦膠質瘤患者預后判定中具有重要的意義[17-18]。本研究中，33例檢測出MGMT基因啟動子區甲基化，其中WHO的分級Ⅰ級2例、Ⅱ級8例、Ⅲ級8例，Ⅳ級15例，分級在MGMT基因啟動子區甲基化分布中，差異無統計學意義，此結果和國外研究結果基本一致[19-20]。IDH 1/2基因突變與MGMT基因啟動子區甲基化呈現明顯正相關，提示可能因IDH 1/2基因突變型的腦膠質瘤中，2-羥基戊二酸蓄積有密切的關系，同時，2-羥基戊二酸積累對于調節DNA甲基化酶形成競爭性抑制，造成患者CpG島甲基化表型進展，進而誘導MGMT基因啟動子區甲基化。此結果也印證了有關學者研究中，MGMT基因啟動子區域甲基化和轉錄沉默，增加了遺傳的不穩定性，也就是促進出現了G和A轉錄因子，進而造成IDH1/2 的132位上的基因突變。此結果和Turcan等[21]研究中，靶向的DNA甲基化可以將IDH1/2基因突變的甲基化逆轉，進而對腦膠質瘤起始細胞的分化形成阻斷，有利于控制腫瘤進展，為指導腦膠質瘤治療提供依據。

表1 腦膠質瘤患者IDH 1/2基因突變與MGMT基因啟動子區甲基化情況

綜上所述，腦膠質瘤患者IDH1/2基因突變與MGMT基因啟動子區甲基化呈正相關，為指導臨床診斷治療，提供了理論依據。