IFCC參考方法評價兩個常規系統血清肌酸激酶測定結果的正確度

王 珊 李文娟 梁海港 黃婷婷 吳澤東

安徽伊普諾康生物技術股份有限公司，安徽合肥 230000

肌酸激酶（creatine kinase，CK）是一個與細胞內能量運轉、肌肉收縮、ATP再生等有直接關系的重要激酶[1-2]，其血清水平在診斷心肌損傷及骨關節炎等方面具有重要的臨床意義[3-7]。目前檢測CK方法主要有國際臨床化學和實驗室醫學聯盟（International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine，IFCC）參考方法和常規生化方法，其中常規生化方法操作簡便，成本低，故臨床應用廣泛[8-11]。由于CK檢測結果易受濃度、pH值、溫度等多種因素的影響，導致結果差異大。本文采用A、B兩種測量系統同時測定有證標準物質、新鮮血清以及IFCC國際參考實驗室能力驗證（IFCC-RELA）樣本，將結果與IFCC參考方法測定結果進行比對，最終按美國臨床和實驗室標準協會（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）EP09-A3文件對正確度進行評價。

1 材料與方法

1.1 儀器

日本日立公司HITACHI 7180 全自動生化分析儀、日本島津UV 2700型紫外可見分光光度計、美國FLUKE 1523型點溫度計、瑞士梅特勒XSE205DU型分析天平、瑞士梅特勒型S220型pH計、美國Hamilton公司Microlab 600稀釋配液儀、德國Eppendorf移液器、日本ASONE容量瓶。

1.2 試劑

參考方法試劑：氯化鈉、氫氧化鈉、甘油、醋酸鎂、D-葡萄糖、β-D-葡萄糖-6-磷酸鈉鹽和二水乙二胺四乙酸二鈉鹽均購自美國Sigma公司；咪唑、醋酸和N-乙酰-L-半胱氨酸均購自德國Merck公司；六水5"-單磷酸腺苷、三水三磷酸腺苷二鈉、二磷酸腺苷單鉀鹽和β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸二鈉鹽均購自瑞士Sorachim公司；P1，P5-二腺苷-5"五磷酸五鋰鹽、己糖激酶（HK）和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G-6-PDH）均購自瑞士Roche公司；四水磷酸肌酸二鈉鹽購自日本OYC公司；常規方法試劑：A公司、B公司生產的CK試劑盒。

1.3 標準物質、質控品和血清樣品

標準物質：有證標準物質ERM-AD455k購自歐盟委員會（European commission），認定值為（314.00±6.00）U/L；2018年CK國際參考實驗室室間比對樣本RELA A和RELA B由IFCC提供，德國臨床化學與檢驗醫學學會（German Society of Clinical Chemistry and Laboratory Medicin，DGKL）認 定 值 為（357.12±6.24）U/L和（326.88±5.70）U/L。質控品：英國朗道（貨號：HN1530-1285UN和HE1532-983UE）。

血清樣品：40例不同濃度新鮮單人份血清，CK催化活性濃度范圍為10～1000 U/L。

1.4 實驗方法

1.4.1 參考方法檢測方案 按照IFCC參考方法準備實驗條件，用2018年RELA樣品確認參考方法測量結果的精密度，要求樣品每天測定5次，連續測定2 d，10次測定結果變異系數（CV）≤1%。用有證標準物質ERM-AD455k確認參考方法的正確度，3次測量結果在“認定值±不確定度”范圍內。在參考方法精密度和正確度達到要求后進行40份血清樣品測定。測定順序為質控→樣品→質控，每個樣品重復測定2次，每10份血清加測一個質控。

1.4.2 常規方法測量方案 A、B兩個測量系統分別由 A、B廠家校準品、質控品及試劑盒、日立7180全自動生化儀組成，亦稱為A法、B法；兩種測量系統在同一臺儀器的不同測量通道上同時進行。儀器進行相應校準后，對40份新鮮血清樣品和RELA樣本進行測定，測量順序為：質控→樣品→質控，每個樣品重復測量2次，其均值作為評價數據。

1.5 數據處理

根據CLSI EP09-A3文件，將兩個測量系統的測定結果分別與IFCC測定結果進行比較，從而評價兩種常規檢測系統測量結果的正確度，并用Excel繪制的直線回歸圖和Origin 8繪制改良Bland-Altman圖形共同進行分析驗證。

2 結果

2.1 測定數據有效性檢驗

本實驗全部數據經檢驗無離群值。

2.2 IFCC參考方法正確度和精密度的確認

采用2018年RELA樣本對精密度進行確認，其CV＜1%，參考方法對有證標準物質ERMAD455k測定結果的確認，3次測定結果均在“認定值±不確定度”范圍內。故符合性能要求，見表1。

表1 IFCC參考方法正確度和精密度的確認

2.3 質控樣本的測定結果

分別采用IFCC參考方法、A和B兩種測量系統檢測質控樣本（朗道公司HN1530-1285UN和HE1532-983UE），見表2。結果表明，B法測量兩個質控樣本和IFCC參考方法測定值均在結果要求（等效限±5.25%）范圍內，其偏倚結果較為一致。而A法測量兩個質控樣本測定值均在結果要求（等效限±5.25%）范圍外，且均明顯偏低。

2.4 A、B測量系統測定結果的比較

采用A、B測量系統在日立7180全自動生化儀上分別對40例不同濃度新鮮單人份樣本血清進行同時測定，見表3。

表2 質控樣本測定結果

表3 A、B法與IFCC方法測定結果

以B法測定結果為X軸，A法測定結果為Y軸作直線回歸圖，可見A、B兩法存在明顯差異，A法的測定結果均偏低于B法，見圖1。

圖1 A、B兩測量系統測定結果比較

2.5 A、B測量系統分別與IFCC參考方法的比較

采用A、B兩測量系統在日立7180全自動生化儀上分別對40例不同濃度新鮮單人份樣本血清進行同時測定，見表3。以IFCC參考方法作為參比方法，A、B法作待評價方法，利用直線回歸圖和改良Bland-Altman圖形分析法進行評價，分別以A、B法為Y軸，與X軸的參考方法作直線回歸圖（圖2、3）和Bland-Altman圖（圖4），發現B法與IFCC參考方法結果較為一致，其平均偏倚范圍在1.53%，在IFCC參考方法允許范圍內，而A法與IFCC參考方法結果存在明顯偏差，其平均偏倚范圍為-6.25%，超出IFCC參考方法允許范圍（±5.25%）。

圖2 A測量系統與IFCC法測定結果直線回歸圖

圖3 B測量系統與IFCC法測定結果直線回歸圖

圖4 A、B測量系統與IFCC參考方法測定結果的Bland-Altman圖注：A法平均偏倚為-6.25%；B法平均偏倚為1.53%

2.6 A、B兩測量系統校準品基質效應的評價

分別用IFCC參考方法和A、B測量系統在日立7180全自動生化儀上對20例不同濃度新鮮單人份樣本血清進行測定。根據CLSI EP14-A2文件對基質效應的評價，將20例不同濃度新鮮單人份樣本血清和A、B校準品用進行A、B兩測量系統重復性測試的均值為Y軸，用IFCC參考方法的均值為X軸作散點圖，采用Origin 8作圖軟件評價A、B兩校準品的基質效應。

A、B兩校準品均位于IFCC參考方法分別與A、B兩測量系統的直線回歸方程95%置信區間外，說明均存在基質效應，其中A校準品的基質效應較明顯。見圖5、6。

圖5 A校準品基質效應

圖6 B校準品基質效應

3 討論

本研究通過檢測2018年RELA確認參考方法的精密度、檢測ERM-AD455k確認參考方法的正確度，以IFCC-RELA對CK的等效限（± 5.25%）作為合格指標，根據EP09-A3文件評價常規測量系統測定結果的正確度，采用IFCC參考方法和A、B兩測量系統在同一全自動生化儀不同通道上分別對40例不同濃度新鮮單人份樣本血清進行測定，結果顯示A、B兩個常規測量系統的測定值具有顯著差異。

為了驗證A、B兩種方法與IFCC參考方法的一致性，本研究利用Excel繪制的直線回歸方程和Origin 8制作的改良Bland-Altman圖形進行分析。其中A法與IFCC參考方法的直線回歸方程為YA= 0.9814X-4.0506，R2= 0.9986，B法 與IFCC參考方法的直線回歸方程為YB= 1.0124X+ 0.5383，R2= 0.9995，A法與B法的直線回歸方程為Y= 0.9791X-5.0766，R2= 0.9977。分析結果可見，A、B兩法均與IFCC參考方法有良好的相關性，且A、B兩法的相關性也符合R2＞0.95要求。但通過改良Bland-Altman圖形分析，B法測定結果的大部分散點位于“0”點之上，與參考方法的測定結果存在一定程度的正向偏倚，B法平均偏倚為1.53%；A法測定結果的散點均位于“0”點之下，與參考方法的測定結果存在著一定程度的負向偏倚，A法平均偏倚為-6.25%。根據回歸方程與改良Bland-Altman圖形分析，B法與IFCC參考方法測定結果較為一致，在 IFCC參考方法允許偏倚范圍內，提示B法測定結果正確；而A法與IFCC參考方法測定結果正確度性能不一致，整體偏低，且結果已超出IFCC參考方法的允許偏倚范圍，提示A法測定結果不正確。

為了保證常規檢測系統的準確性和可比性，血清酶學參考系統是實現酶學檢測結果溯源性的基礎[12]。常規檢測系統只有溯源至參考方法或參考物質，才能夠有效的減小臨床檢測結果與靶值的偏倚，研究發現[13-15]校準品是否具有互換性是影響常規方法檢測結果的重要因素，故本文對A、B兩校準品進行互換性評價。依據EP14-A2文件，提示A、B校準品的測定值均位于回歸方程95%置信區間外，說明都存在基質效應，但A校準品的基質效應較明顯，推測可能是導致測定結果不正確的主要原因，B校準品雖存在基質效應，但對檢測系統測定結果的正確度未產生太大的影響。

綜上所述，A、B兩個常規測量系統測定同一樣本在同一儀器上的測定結果存在著顯著的差異，這種現象說明常規測量系統缺乏溯源性，只有在特異性與參考方法相同或相近的常規方法才能通過不間斷的溯源鏈更好的實現溯源，故建議有關研發、生產單位有必要對常規測量系統的正確度以及校準品的互換性進行評價。