復合因素糖尿病下肢潰瘍大鼠模型建立的初探

王鑫，許志明，李曉陽，石育弘，曾昭洋*

(1.甘肅中醫藥大學，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅中醫藥大學附屬醫院，甘肅 蘭州 730020)

0 引言

糖尿病足潰瘍(DFU)是糖尿病患者可能面臨的最漫長且代價高昂的挑戰，同時DFU 往往會發生在5-7%的糖尿病患者人群中[1]。并且這些潰瘍中有又有一半以上是因為被感染[2]。在大多數情況下，嚴重的感染才是導致DFU 患者全肢體截肢的重要原因[3]。同時有研究指出金黃色葡萄球菌是DFU 中感染的主要微生物[4]。糖尿病足(DF)的病理過程非常復雜，涉及皮膚、肌肉、肌腱、骨、神經和血管的損傷。而糖尿病足感染(DFI)是指微生物的入侵及其在宿主組織中的繁殖，在臨床中通常引發于體表屏蔽層的不慎開裂破損。本研究擬制備一種符合糖尿病下肢潰瘍發病過程的可操作性強的復合因素模型，在高脂高糖飼料投喂下聯合鏈脲佐菌素(STZ)腹腔注射誘導的2 型糖尿病大鼠基礎上，采用彈性膠布包裹，足底皮膚切除，創面肌腱下注射金黃色葡萄球菌質控菌株來建立復合因素糖尿病潰瘍模型，以期為更加符合臨床發病危險因素特點的糖尿病下肢潰瘍模型提供新思路。

1 材料

1.1 實驗動物

健康SPF 級雄性SD 大鼠30 只(甘肅中醫藥大學SPF 級實驗動物中心提供，動物合格證號：SCXK(甘)2020—0009)，體重(180±20)g。

1.2 藥物及試劑設備

STZ 鏈脲佐菌素(Sigma 公司)；檸檬酸(北京索萊寶科技有限公司)；檸檬酸鈉(北京索萊寶科技有限公司)；質控菌株金黃色葡萄球菌-ATCC29213，菌懸液濃度1×108/mL(甘肅中醫藥大學附屬醫院檢驗科提供)；羅氏活力型血糖儀(蘭州科寶生物科技有限公司)。

2 方法

2.1 模型建立及分組給藥

糖尿病模型的制備首先對SD 大鼠進行高脂高糖飼料投喂1 月，禁食1 日后腹腔注射STZ 35mg/kg，假手術組注射同等計量的檸檬酸鈉緩沖液。3 日后測空腹血糖大于11.1mmol/L 或隨機血糖大于16.7mmol/L 視為造模成功，并應在實驗過程中每周復測血糖，及時剔除回落不符合標準的大鼠。糖尿病大鼠模型制備后1 周復測血糖符合標準后，開始進行糖尿病潰瘍造模。將大鼠右后腿用外科彈性膠布包裹4小時后，松開膠布。腹腔注射麻醉大鼠，所用藥物為3%戊巴比妥鈉(劑量為0.1mL/100g)。麻醉狀態穩定后，右后足剃凈絨毛，碘伏消毒三遍。用手術刀及組織剪在每只大鼠右足底爪墊后跟上，沿其自然分界剪切出了一個上底為8mm，下底為3mm，高為15mm 的梯形全層傷口。具體過程為去除全層皮膚，粗紗布拭去淺層組織并逐漸至深筋膜，后用組織剪分離深達深筋膜下，并顯露出大鼠足底肌腱，使用止血鉗內側面機械損傷肌腱。術中使用棉球止血，待出血停止后，進行感染菌的接種。將金黃色葡萄球菌懸液(濃度1×108/mL)用磷酸鹽緩沖液(PBS)10 倍梯度稀釋，每個足底創面朝足尖方向注射該濃度菌液0.1mL。

具體分組為，從30 只SD 大鼠中選擇10 只作為假手術組，其余大鼠均進行糖尿病造模，建造成功后。隨機將糖尿病大鼠分為復合因素組(n=10)和單純切除組(n=10)。將三組大鼠進行下肢潰瘍造模后，術后常規包扎1 日，于第2 日開始松開紗布，使其自然愈合。觀察三組下肢潰瘍創面愈合情況。

2.2 觀察指標

2.2.1 一般情況觀察

觀察大鼠造模前后大鼠外觀、尿量及活動情況。

2.2.2 大鼠體重檢測

分別于腹腔注射STZ 前，注射后2、4、6 周分別測量各組大鼠空腹體重。

2.2.3 大鼠血糖監測

分別于腹腔注射STZ 前，注射后3、7、14 天分別監測大鼠空腹血糖(Fasting Blood Glucose，FBG)、餐后2 小時血糖(Postprandial Blood Glucose，PBG)；具體測量方法：將大鼠置于大鼠固定裝置后，尾端顯露于其外，將試紙插進血糖儀待血糖儀指示后，用75%的酒精消毒大鼠尾尖，采血針垂直刺入，用另只手的大拇指和食指由大鼠尾巴近心端向遠心端驅血，無菌棉球拭去第一滴血，再驅血讓血液沾染到試紙(試紙上橫向黑色條為采血處)即可。

2.2.4 創面愈合率

將三組大鼠進行下肢潰瘍造模后，術后常規包扎1 日，于第2 日開始松開紗布，待其自然愈合。觀察三組下肢潰瘍創面愈合情況。期間觀察每只大鼠的活動、進食、飲水及其他異常情況。各組大鼠均于制創后的第3，7，14 對大鼠進行潰瘍創面拍照，用Image J 軟件測定潰瘍創面面積，計算創面愈合率。其中創面愈合率=(原始創面面積-未愈合創面面積)/原始創面面積×100%。

2.2.5 創面愈合時間

以創面愈合面積≥95%糖尿病下肢潰瘍面積為完全愈合，分別記錄每只小鼠創面愈合時間。

2.2.6 于潰瘍形成后第14 天三組各隨機取1 只大鼠,切取大鼠足底潰瘍面及周圍全層皮膚,10%多聚甲醛固定,石蠟包埋,HE 染色,光鏡下觀察愈合情況。

2.3 統計方法

結果用表示，所有數據做方差齊性檢驗，符合正態分布的采用單因素方差分析，P＜0.05 為有統計學差異。

3 結果

3.1 大鼠一般狀況

大鼠腹腔給予STZ 后，第3 日即出現明顯的多飲、多食、多尿及糞便增多現象，其中尤以多飲、多尿最顯著。彌漫爛蘋果樣的特殊氣味等典型的糖尿病癥狀，隨著時間延長，上述癥狀逐漸加重。至第2 周逐漸開始，單純切除組與復合因素組均出現精神萎靡，行動遲緩，皮毛灰黃無光澤，消瘦，飲水量及小便量已達到正常大鼠的5～6 倍，進食量為正常大鼠的2～3倍。假手術組組大鼠則精神良好，行動敏捷，二便正常，體重逐漸增長。

足底制創后，假手術組大鼠潰瘍面肉芽組織爬生良好，滲出物較少；復合因素組糖尿病足底制創后患足紅腫、感染、黃色膿性分泌物形成。而單純切除組下肢潰瘍面僅變現為紅腫，滲出物稍多。

3.2 大鼠體重變化

腹腔給藥STZ 前，三組大鼠之間體重無明顯變化。給藥后第2 天，單純切除組、復合因素組大鼠尿量明顯增加，假手術組無明顯變化。給藥后前3 天，三組大鼠體重無明顯變化；給藥后2w、4w、6w 測量大鼠體重，單純切除組、復合因素組大鼠體重逐漸減輕，與假手術組比較差異具有統計學意義(P＜0.05)；給藥后，單純切除組、復合因素組大鼠體重均減輕，差異無統計學意義(P＞0.05)。見表1。

表1 各組大鼠不同時間點體重情況()

表1 各組大鼠不同時間點體重情況()

3.3 大鼠血糖的變化

腹腔給藥STZ 前，三組大鼠空腹血糖無明顯變化；給藥后3d、7d、14d 檢測FBG、PBG，結果顯示單純切除組、復合因素組空腹血糖較假手術組明顯升高，給藥后，單純切除組與復合因素組FBG、PBG 升高水平的差異不具有統計學意義(P＞0.05)；假手術組FBG、PBG 較前無明顯變化。給藥后2w，單純切除組與復合因素組整體血糖水平逐漸呈上升趨勢。見表2。

表2 給藥后各組大鼠不同時間點FBG、PBG 水平()

表2 給藥后各組大鼠不同時間點FBG、PBG 水平()

3.4 創面愈合情況及愈合率見表3 及

表3 各組大鼠創面愈合率比較()

表3 各組大鼠創面愈合率比較()

各組大鼠創面隨著時間推移不斷愈合，其中假手術組愈合效果最好，其次為單純切除組，而復合因素組愈合率最差。復合因素組與單純切除組相比，在第3 天、7 天和14 天的創面愈合率顯著降低(P＜0.05)；與假手術組之間不具有統計學差異(P＞0.05)。

3.5 創面愈合時間

與其他組相比，復合因素組糖尿病潰瘍創面愈合時間明顯延長，差異具有統計學意義(P＜0.05)；而單純切除組創面愈合時間長于假手術組，差異具有統計學意義(P＜0.05)，結果見表4。

表4 各組大鼠糖尿病潰瘍創面愈合率()

表4 各組大鼠糖尿病潰瘍創面愈合率()

3.6 糖尿病足潰瘍大鼠模型制作結果

病理學觀察：潰瘍形成后第14 天，病理結果示復合因素組局部覆蓋血痂，肉芽組織較多，表皮覆蓋不完全，創面炎癥反應重，愈合差；單純切除組肉芽組織不明顯，表皮覆蓋完整，皮下纖維組織排列規則，見有散在炎性細胞，愈合尚好。而假手術組則較單純切除組新生血管變得豐富，且管腔較大，大量的紅細胞位于管腔中。復合因素組成功建立糖尿病下肢潰瘍模型。

4 討論

糖尿病下肢潰瘍作為糖尿病的并發癥之一，具有遷延難愈、治療過程漫長且反復發作等特點，往往使患者及其家庭的現實負擔加重并身心俱疲[5]。糖尿病下肢潰瘍的發生是由血管病變、神經病變、局部感染及足底生物力學改變等多種危險因素共同作用的病理結果。在研究中，重要的是動物模型要模擬病人傷口愈合延遲的潛在病理生理機制。但目前，對于哪種動物模型最能代表人類糖尿病下肢潰瘍尚無共識[6]。在過去的糖尿病下肢潰瘍研究中，切除傷口模型被認為更適合研究潰瘍傷口愈合，因為它會產生更多的疤痕組織便于進行實驗分析[7]。通常在大鼠或小鼠背部造成傷口[8-11]。但這些傷口模型都沒有使用2 型糖尿病動物而是1 型糖尿病。由于全世界90%的糖尿病患者患有2 型糖尿病[12]，并在此基礎上不慎形成糖尿病下肢潰瘍。上述模型的造模方式的優勢在于，進行創面面積的量化分析便于臨床實際中的療效評價，尤其是用于外用輔料及藥物的研究，可獲得能夠分辨新生上皮與肉芽界限的圖像。Jeremy Rich 等[13]建立的金黃色葡萄球菌感染NOD 小鼠后肢模型，該研究采用金黃色葡萄球菌感染的方法對糖尿病下肢潰瘍模型的建立具有重要的借鑒價值。由于骨骼和皮膚之間的軟組織很薄，機械壓力和剪切力的緩解是糖尿病下肢潰瘍管理中的一個關鍵因素[14]。在模擬糖尿病下肢潰瘍生物力學因素時，局部加壓對末梢微循環及神經改變很有意義。同時，將潰瘍面建立在大鼠足底也更加符合臨床實際發病過程，且這種潰瘍面常規包扎后由于大鼠活動的進行依然產生慢性機械損傷，這將與糖尿病下肢潰瘍遷延難愈的病理表現一致。因此建立一個與臨床發病危險因素相符合的動物模型對于糖尿病下肢潰瘍的研究是有現實意義的，而且應該是2 型糖尿病基礎上的足底復合因素的模型。

課題組通過建立這種符合糖尿病下肢潰瘍發病過程的可操作性強的復合因素模型，結果表明投喂高脂高糖飼料聯合STZ 給藥注射后，糖尿病模型穩定。同假手術組比較，單純切除組與復合因素組大鼠體重逐漸減輕；單純切除組、復合因素組FBG、PBG 水平相比較假手術組明顯升高。模擬糖尿病下肢潰瘍發病的多種危險因素，采用包括了局部加壓、全層足底皮膚切除、機械毀傷并接種感染菌液的復合方式后，假手術組大鼠潰瘍面肉芽組織爬生良好，滲出物較少；復合因素組糖尿病足底制創后患足紅腫、感染、黃色膿性分泌物形成。而單純切除組下肢潰瘍面僅變現為紅腫，滲出物稍多。結合大鼠一般情況該模型比較符合臨床2 糖尿病患者因足部外屏障破裂遷延難愈發展為糖尿病下肢潰瘍的病理過程。

綜上所述，建立這種與臨床發病危險因素相符合的2 型糖尿病基礎上的足底復合因素模型是便于糖尿病下肢潰瘍研究的。