萍鄉搓菜復合發酵菌劑的研究

曹余，鄧澤元，魏長浩，余誠瑋，李紅艷*

1(食品科學與技術國家重點實驗室(南昌大學)，江西 南昌，330047) 2(南昌大學 食品學院，江西 南昌，330031)

萍鄉搓菜是江西萍鄉傳統的蔬菜干腌制品，其制作工藝已有上百年的歷史。萍鄉搓菜在制作的過程中不添加食用鹽，亞硝酸鹽含量低，相比于傳統發酵的泡菜、酸菜等產品更能滿足人們對低鹽健康食品的追求[1]。同時，由于搓菜產品是使用半干的蔬菜發酵而成，故其含水量較低，更利于保存和運輸。但目前多是以自然發酵的方式生產，受自然條件因素影響很大，且耗時數月，極大地限制了搓菜的工業化生產及經濟效益，因此，研究搓菜發酵所需的最佳菌劑配比，對于工業化生產搓菜尤為重要。

早期已有研究人員將Lactobacillusplantarum∶Pichiakudriavzevii=1∶3混合投入發酵搓菜，結果發現投入復合發酵菌劑后可降低搓菜中亞硝酸鹽含量，且風味物質種類與自然發酵相似，僅含量上略有差別[2]。本實驗在前期研究的基礎上，從自然發酵搓菜中分離篩選出多株優勢菌種，通過研究各菌株的發酵性能及菌種間相互作用，將Lactobacillusbuchneri、Lactobacillussunkii、L.plantarum、Lactobacillusbrevis、P.kudriavzevii、Kazachstaniabulderi以不同配比發酵搓菜，對比自然與人工菌劑發酵搓菜的品質，選擇出最佳發酵菌劑配比，以求在保證發酵搓菜品質穩定的基礎上，進一步縮短搓菜的發酵周期。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮芥菜，南昌市上海北路菜市場；C5～C10、C10～C25正構烷烴，上海安譜實驗科技股份有限公司；葡萄糖等培養基用試劑均為分析純。

1.2 培養基

生長培養基：MRS液體培養基，YPD液體培養基。

初篩培養基：MRS固體培養基中加0.04%(質量分數)溴甲酚紫，YPD固體培養基。

鑒定培養基：糖發酵培養基，明膠液化培養基，硝酸鹽培養基，產硫化氫試驗培養基，吲哚培養基；碳源同化培養基，氮源同化培養基，產類淀粉培養基，無維生素培養基。

1.3 儀器與設備

LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫療器械公司；TA-XT plus質構儀，英國Stable Micro System公司；3nh高精度色差儀，深圳市三恩馳科技有限公司；單重四級桿氣相色譜-質譜聯用儀，美國安捷倫公司等。

1.4 試驗方法

1.4.1 菌種的篩選

用無菌生理鹽水適當稀釋搓菜樣品，取不同稀釋度涂布于初篩平板，倒置培養48 h，取平板上形態不同的菌落，分別在初篩培養基上劃線分離，重復分離3～4次，鏡檢后于-20 ℃甘油保藏。

1.4.2 菌種的鑒定

1.4.2.1 生理生化鑒定

乳酸菌鑒定方法[3-4]：革蘭氏染色、過氧化氫酶試驗、硝酸鹽還原試驗、明膠液化試驗、吲哚試驗、產H2S試驗、pH 4.5生長試驗、糖或醇發酵試驗、葡萄糖產酸產氣試驗。

酵母菌鑒定方法[5-6]：糖發酵試驗、碳源同化試驗，氮源同化試驗、無維生素生長試驗、37 ℃生長試驗、產類淀粉試驗。

1.4.2.2 分子生物學鑒定

通過生理生化鑒定初步判定后，進行基因測序鑒定，主要步驟為：提取DNA，PCR擴增，切膠純化測序，拼接序列，最后與NCBI數據庫進行比對，將同源性較高的典型菌株的序列用于構建系統發育樹。

1.4.3 發酵搓菜用菌種的篩選

1.4.3.1 菌種間相互作用的分析

菌種間拮抗實驗采用牛津杯法[7]。

1.4.3.2 乳酸菌產酸能力的測定

參照GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》，每4 h測酸度(以乳酸計)和pH值。

1.4.3.3 酵母菌耐酸能力的測定

在初始pH值為2、3、4、5、6的YPD液體培養基中培養一定時間后測菌液在600 nm處的OD值。

1.4.4 菌種內最佳配比的探究

1.4.4.1 發酵菌株菌種內配比的探究

將乳酸菌和酵母菌進行菌種內復配，20 ℃下培養一定時間，測定混合菌液在600 nm處的OD值，分別取酵母菌和乳酸菌菌種內配比生長狀況較好的前3組，按酵母菌與乳酸菌3∶1的比例混合，以1%接種量接種于半干芥菜上，20 ℃發酵50 d，與自然發酵的產品對比。

1.4.4.2 質構與色澤的測定

質構：采用直徑為5 mm的圓柱形探頭進行質地多面分析(texture profile analysis，TPA)實驗[8]。測試參數為：測前速度1 mm/s，測試速度1 mm/s，測后速度1 mm/s，壓縮程度40%，2次壓縮間隔時間為5 s，觸發點負載5 g。

色澤：使用色度計測定搓菜的色澤[9]，記錄L*、a*、b*值，總色度C*的計算如公式(1)所示：

C*=(a2+b2)1/2

(1)

1.4.4.3 感官品質評價

邀請10名感官評價參與者對10種產品進行綜合打分[10]。

1.4.5 發酵搓菜風味物質的分析

萃取條件:取4 g剪碎的搓菜，置于15 mL頂空瓶中，45 ℃下預熱30 min，將頂空固相微萃取(headspace-solid phase micro extraction，HS-SPME)萃取頭插入萃取瓶中，45 ℃萃取30 min，拔出萃取頭插入GC-MS進樣口，解吸5 min。

色譜條件：HP-5MS毛細管色譜柱(30 m×0.32 mm，0.25 μm)，進樣口溫度250 ℃。升溫程序：起始柱溫35 ℃，保持3 min，5 ℃/min線性升溫至100 ℃保持2 min，10 ℃/min線性升溫至220 ℃保持15 min。載氣為He，流量1 mL/min，不分流。

質譜條件：電子轟擊離子源；電子能量70 eV，電離源溫度230 ℃，傳輸線溫度280 ℃；掃描范圍50～550 u。

1.4.6 數據處理

利用C5～C10、C10～C25正構烷烴為混標計算各化合物的保留指數(retention index，RI)對化合物進行定性，用面積歸一法計算百分含量。采用單因素方差分析(ANOVA)和Duncan檢驗，采用SPSS 25統計軟件，以P<0.05為顯著性差異。采用Excel 2016進行圖表繪制。

2 結果與分析

2.1 菌種的篩選與鑒定

從自然發酵搓菜中分離篩得7種不同菌落形態的菌種，生理生化實驗結果如表1和表2所示，菌種系統發育樹如圖1所示。

表1 乳酸菌生理生化實驗Table 1 Physiological and biochemical experiments of lactic acid bacteria

表2 酵母菌生理生化實驗Table 2 Physiological and biochemical experiments of yeast

由生理生化試驗及分子生物學鑒定得Y1為P.kudriavzevii、Y2為K.bulderi、R1為L.buchneri、R2為L.sunkii、R3為L.Alimentarius、R4為L.plantarum、R5為L.brevis，7株菌均為發酵蔬菜中的常見菌株。NGVYEN等[11]研究越南發酵蔬菜中乳酸菌組成，發現植物乳桿菌占比達17.1%，短乳桿菌占比0.5%。LIU等[12]發現發酵芥菜的塊莖中L.Alimentarius豐度達85.8%。LIU等[13]發現發酵泡菜中大量存在P.kudriavzevii和K.bulderi。

2.2 發酵搓菜用菌種的篩選

2.2.1 菌種間的相互作用

酵母菌和乳酸菌的拮抗試驗結果發現，R3與R1、R2、R4之間均有拮抗作用(R3菌液抑制R2、R4生長，R1菌液抑制R3生長)。研究表明，乳酸鏈球菌與保加利亞乳桿菌或干酪乳桿菌混合培養時出現相互拮抗作用，嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌之間也有明顯的拮抗作用[14]。本實驗中，R3與R1、R2、R4之間有拮抗作用，可能是R3在生長的過程中產生某種酶或者細菌素對其他菌種生長有抑制作用。由菌種生長曲線試驗結果可知，R3菌體密度最小，且與另外3株乳酸菌之間有拮抗作用，故R3將不被選為發酵菌劑菌種。

a-乳酸菌系統發育樹；b-酵母菌系統發育樹圖1 菌種系統發育樹Fig.1 Phylogenetic trees of strains

2.2.2 乳酸菌產酸能力的測定

乳酸菌產酸能力的強弱與其自身耐酸能力強弱相關，一般來說，菌種產酸能力越強，耐酸能力也越強。快速大量產酸不僅能快速抑制雜菌生長，保證產品質量，還能使產品快速達到發酵效果，縮短發酵時間[15]。由圖2可知，各菌種在生長過程中酸度變化與pH變化結果相符，R1、R4、R5產酸能力相近，且較R2強，故在發酵菌種配比中將R1、R4、R5以1∶1∶1配比，并將其視為一個整體與R2進行配比。

a-pH;b-酸度圖2 乳酸菌生長過程中pH和酸度變化Fig.2 Variations of pH and acidity during the growth of lactic acid bacteria

2.2.3 酵母菌耐酸能力的測定

在乳酸菌與酵母菌混合發酵體系中，酵母菌的耐酸能力決定它能否在體系中正常生長。由圖3可知，2株酵母菌對于低pH均有良好的耐受性，在pH值為2的條件下，酵母菌OD600nm值仍在0.4左右，且Y1在pH值為5時有最大菌體密度，此結果與劉春燕[16]研究結果相似。

圖3 酵母菌在不同pH條件的生長情況Fig.3 Yeast growth at different pH conditions

2.3 菌種內最佳配比的探究

2.3.1 發酵菌株菌種內配比的探究

由圖4可知，當乳酸菌(R1/R4/R5)∶R2=2∶1、3∶1、3∶2，酵母菌Y1∶Y2=1∶2、1∶3、2∶3時，菌體密度相對較高。在同一生長體系中，當多株菌種混合培養時，菌體密度相對較高，說明混合菌生長狀態較好。因此選擇乳酸菌(R1/R4/R5)∶R2=2∶1、3∶1、3∶2，酵母菌Y1∶Y2=1∶2、1∶3和2∶3進行后續菌種間配比試驗。

a-乳酸菌;b-酵母菌圖4 乳酸菌和酵母菌菌種內配比Fig.4 Interspecific ratios of yeast and lactic acid bacteria注：不同字母表示具有顯著差異(P<0.05)(下同)

2.3.2 質構與顏色的測定

由圖5可知，2、6、7、9及自然發酵組的質構結果相對較好，且2、6、7、9組的黏結性、咀嚼性、彈性均高于或持平于自然發酵組，6、7組的硬度與自然發酵組持平。從質構角度看，加入適宜比例的菌劑后，搓菜的品質有所改善，可能是由于適宜比例的菌劑能夠使菌群生長代謝維持平衡，從而減弱搓菜組織細胞的破壞程度及細胞壁原果膠的水解程度，最終使發酵搓菜的咀嚼性、彈性、黏結性較好[17-18]。搓菜經發酵后，從顏色亮度和總色度上可看出6、7、9和自然發酵組較好，這兩者反映的是搓菜顏色的飽滿度及鮮亮度，亮度越高說明顏色越鮮亮，褐變的程度越小[19]。

2.3.3 感官評定

由感官評定結果可知，1、2、6、7組的總評分較高，感官評定色澤結果與色度計測定結果有略微差異，可能是由于各參評人員感官閾值有所不同。綜合質構與色度結果可看出6、7組發酵效果最好，且其感官評定總評分高于自然發酵組。由于第6組感官評價總評分高于第7組，因此最終選定第6組菌種配比為最終搓菜復合發酵菌劑配比。最終發酵菌劑配比為酵母菌Y1∶Y2=1∶2，乳酸菌(R1/R4/R5)∶R2=3∶2。

表3 感官評價結果表Table 3 Results of sensory evaluation

2.4 發酵搓菜風味物質的分析

利用HS-SPME-GC-MS測定了自然發酵與優選菌劑發酵搓菜中揮發性風味物質，結果如圖6所示。

a-硬度；b-黏結性；c-咀嚼性；d-彈性；e-亮度；f-總色度圖5 發酵搓菜的質構與色澤Fig.5 The texture and colors of fermented Cuocai注：分組1，3，4，5，5，7，8，9分別表示YI∶Y2、(R1/R4/R5)∶R2為1∶3、2∶1，1∶3、3∶1，1∶3、3∶2,1∶2、2∶1，1∶2、3∶1,1∶2、3∶2，2∶3、2∶1,2∶3、3∶1，2∶3、3∶2，自然發酵組表示未接種菌劑

a-種類數量；b-相對含量圖6 不同組搓菜產品中揮發性風味成分類別種數和種類相對含量Fig.6 The varieties and relative contents of volatile flavor components in different groups

優選菌劑發酵和自然發酵搓菜中揮發性風味物質的種類有部分相似，但含量有差別。優選菌劑發酵和自然發酵搓菜中分別檢測出揮發性風味物質71種和53種。酯類物質是發酵蔬菜中最重要的一類風味物質，即使在低濃度下也能散發花香、水果味和蜂蜜味[20]，自然發酵搓菜中含量最高的是硫氰酸香茅酯(2.15%)，而優選菌劑發酵搓菜中異硫氰酸丁酯(4%)、甲酸反式-4-甲基環己酯(4.25%)十二內酯(5.32%)含量都相對較高。其中的異硫氰酸酯不僅是發酵蔬菜重要的特征性風味物質，同時也具有抗癌作用[21]。酯類物質在優選菌劑發酵組中的種類數和相對含量都比自然發酵組高，且是優選菌劑發酵組中含量及種類最豐富的一類物質，這與侯愛香等[22]研究結果一致。這種差異可能是由于自然發酵中有效微生物含量較少，發酵啟動較慢，代謝產物相互作用產生酯類物質較少。

優選菌劑發酵過程中醇類相對含量最高的是具有清甜香氣的苯乙醇，但在自然發酵中并未檢測到，此結果與徐丹萍等[23]研究結果相似，在自然發酵泡菜中未檢測到苯乙醇，但在老泡菜水發酵泡菜中含量卻較高。優選菌劑發酵醇類物質(17.86%)相對含量高于自然發酵(12.99%)，可能是由于優選菌劑發酵接種乳酸菌和酵母菌代謝產生大量醇類物質，使得優選菌劑發酵搓菜中醇類物質較為豐富。酮類和醛類具有較低的氣味閾值和特殊的氣味，醛類具有草本香氣，是氨基酸分解代謝和不飽和脂肪酸自氧化產生的主要物質[24]，而酮類化合物具有甘草味，但二者不穩定，在發酵后期可進一步反應形成酸和醇，優選菌劑發酵組中酮類物質的種類數和相對含量都較自然發酵組高，而醛類物質與之相反，可能是由于自然發酵搓菜啟動較慢，相同條件下被還原的醛類物質相對較少，因此留在產品中醛類物質相對較多。

酸類、烴類和雜環類化合物氣味閾值相對較高，本研究中雜環類化合物相對含量較高，尤其是在自然發酵搓菜中。酸類及烴類物質在兩組間含量差異較大，但對風味直接貢獻不大，僅可與其他物質相互作用或作為其他風味物質的前體[25]。

硫化物，芳香類及胺類物質在兩組樣品中相對含量都較低。芳香類中甲苯在自然發酵中相對含量較高，但在優選菌劑發酵中較低。硫化物和胺類化合物僅在含量上有差異，硫化物氣味閾值較低，且有強烈的洋蔥氣味，對發酵蔬菜的整體嗅覺特性做出了重要貢獻，是發酵蔬菜中最重要的揮發性風味物質之一[26]。

從揮發性風味物質組成看，優選菌劑發酵比自然發酵物質更為豐富，且重要揮發性風味物質占比更高，與感官評定結果相符。此結果進一步說明使用復合菌發酵搓菜可以替代自然發酵搓菜實現工業化生產。

3 結論

本研究從江西萍鄉特色自然發酵搓菜中篩選出7株優勢菌種，通過基礎生理實驗選擇各項生理指標都較強的L.buchneri、L.sunkii、L.plantarum、L.brevis、P.kudriavzevii、K.bulderi作為最終的發酵菌株。經菌種內最佳配比實驗得到乳酸菌(R1/R4/R5)∶R2為2∶1、3∶1、3∶2，酵母菌Y1∶Y2=1∶2、1∶3、2∶3時分別有相對較好的生長狀態。在前期研究基礎上以乳酸菌∶酵母菌=1∶3接種發酵搓菜，經過對發酵后搓菜質構、顏色分析及感官評定結果分析，發現當酵母菌Y1∶Y2=1∶2，乳酸菌(R1/R4/R5)∶R2=3∶2(即R1/R4/R5/R2=1∶1∶1∶2)時發酵所得搓菜綜合評價最好。最后比較自然發酵與優選菌劑發酵搓菜的揮發性風味物質，發現優選菌劑發酵相比于自然發酵物質更為豐富，且重要揮發性風味物質占比更高。此研究結果可為快速高效的發酵萍鄉搓菜提供科學的理論指導。