補(bǔ)腎清肝疏脾法對(duì)2型糖尿病SD大鼠模型腸道菌群改善及MAPK信號(hào)通路的影響*

范艷艷 陳 晟 邢 俊 陳勁宇

(1. 江蘇省南通市中醫(yī)院急診內(nèi)科,南通 226001)(2. 南通市第一人民醫(yī)院骨科,南通 226001)

2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)是一種以糖代謝紊亂為主、慢性的、全身性的代謝性疾病[1]，已成為繼心腦血管疾病及腫瘤之后的又一嚴(yán)重危害人類健康的慢性非傳染性疾病，并造成了相當(dāng)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[2-3]。

最新的研究發(fā)現(xiàn)，腸道菌群與T2DM的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，并對(duì)T2DM存在多種不同調(diào)節(jié)機(jī)制。MAPK信號(hào)通路在維持機(jī)體內(nèi)的葡萄糖穩(wěn)態(tài)等生理過程中發(fā)揮重要作用[4-5]。無菌小鼠實(shí)驗(yàn)表明，腸道微生物菌群的組成與無菌小鼠肥胖增加及MAPK信號(hào)通路中的短鏈脂肪酸受體(GPR)41、43及胰高血糖素樣肽-1(glucagon-like peptide，GLP-1)在遠(yuǎn)端小腸的表達(dá)降低相關(guān)[6]。而GPR41的缺乏與酪氨酰酪氨酸肽(PYY)蛋白的表達(dá)減少有關(guān)。PYY是一種腸道分泌的細(xì)胞源性激素，通常會(huì)抑制腸道蠕動(dòng)，增加腸道轉(zhuǎn)運(yùn)率，減少從飲食中獲取能量(短鏈脂肪酸)。由此可見，MAPK信號(hào)通路中GLP-1與PYY是通過腸道菌群與T2DM有密切關(guān)系，GLP-1和PYY的變化可能是調(diào)節(jié)腸道菌群的因素之一[7-10]。

因此，本研究通過觀察補(bǔ)腎清肝疏脾法對(duì)高脂高糖餐誘導(dǎo)的2型糖尿病SD大鼠模型血糖、血脂、胰島素、體質(zhì)量等指標(biāo)及其與腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響，并測(cè)定小腸遠(yuǎn)端GLP-1和PYY的含量，探討中醫(yī)補(bǔ)腎清肝疏脾法對(duì)肥胖與糖尿病的治療效果。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)健康SD雄性大鼠，體質(zhì)量180～200 g， 6～8周齡，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(湘)2016-0002。常規(guī)條件飼養(yǎng)，按正常晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)光照時(shí)間，保持室溫22～26 ℃，相對(duì)濕度50%～60%。

1.2 模型制備

1.2.1造模方法:SD大鼠經(jīng)8周高脂高糖飼料(鼠維持飼料 67.5%、豬油10%、蔗糖20%、蛋黃粉2.5%)飼喂。造模成功的大鼠需滿足：體質(zhì)量及增長情況顯著大于空白組，且造模組大鼠空腹一次性腹腔注射pH 4.4枸椽酸鈉緩沖液配制的STZ溶液30 mg/kg，7 d后經(jīng)大鼠尾靜脈取血，血糖值為16.7～30 mmol/L。

1.2.2分組:造模成功的大鼠隨機(jī)分為模型對(duì)照組(對(duì)照組)和補(bǔ)腎清肝疏脾組(實(shí)驗(yàn)組)，正常飼養(yǎng)組(空白組)給予普通飼料，每組8只。補(bǔ)腎清肝疏脾組大鼠采用蒸餾水制備的中藥方劑進(jìn)行灌胃，按照“動(dòng)物與人體的每千克體質(zhì)量劑量折算系數(shù)表”中等劑量計(jì)算，大鼠灌胃劑量(g)=6.25×2×人劑量×(鼠體質(zhì)量/人體質(zhì)量)，大鼠灌胃容積為20 mL/kg，根據(jù)劑量和容積可以得出給藥濃度(總藥材量/灌胃容積)。每周按大鼠體質(zhì)量計(jì)算灌胃藥量，其他兩組灌胃無菌水。三組大鼠喂養(yǎng)6個(gè)月之后，采集樣品，進(jìn)行分析研究。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1腸道菌群的檢測(cè):糞便基因組DNA提取試劑盒提取大鼠糞便基因組總DNA，-20 ℃凍存。用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)方法對(duì)大鼠糞便中乳酸桿菌、雙歧桿菌、大腸桿菌及糞腸球菌16S rDNA V3可變區(qū)進(jìn)行定量分析并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，將提取的大鼠糞便基因組DNA進(jìn)行以上4種菌株16S rDNA V3可變區(qū)qPCR反應(yīng)，反應(yīng)體系及反應(yīng)條件與標(biāo)準(zhǔn)曲線制備相同，即：預(yù)變性95 ℃、15 min；變性95 ℃、10 s；最佳退火溫度(雙歧桿菌61 ℃、乳酸桿菌55 ℃、大腸桿菌51 ℃、糞腸球菌52 ℃)、20 s；延伸72 ℃、30 s；共50個(gè)循環(huán)，反應(yīng)完畢后進(jìn)行熔解曲線分析。根據(jù)讀取的熒光數(shù)據(jù)，由系統(tǒng)軟件Eppendorf Mastercycler ep realplex 自動(dòng)分析Ct(PCR擴(kuò)增過程中，擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)過的循環(huán)次數(shù))，將Ct值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出大鼠糞便樣品中4種菌株的含量。

1.3.2腸道GLP-1和PYY表達(dá)的測(cè)定:取大鼠遠(yuǎn)端小腸樣本，提取蛋白， Western blot檢測(cè)PYY、GLP-1的含量，使用大鼠PYY ELISA檢測(cè)試劑盒(北京嘉美紐諾生物科技有限公司)進(jìn)行PYY表達(dá)的測(cè)定。

1.3.3宏觀生理生化指標(biāo)的測(cè)定:每天測(cè)量大鼠進(jìn)食量，每周測(cè)量1次大鼠體質(zhì)量。生化法測(cè)定血脂和空腹血糖(FBG)，放免法測(cè)定空腹胰島素(FINS)，并通過以下公式計(jì)算胰島素分泌指數(shù)(HOMA-β)。

HOMA-β=20×FINS/(FBG-3.5)。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠腸道菌群的變化

由表1可知，對(duì)照組大鼠腸道內(nèi)雙歧桿菌、乳酸桿菌顯著降低，而糞腸球菌、大腸桿菌數(shù)量均出現(xiàn)了明顯的增加。

表1 各組大鼠實(shí)驗(yàn)6個(gè)月后腸道菌群的變化情況Table 1 Changes of intestinal flora of rats ineach group after 6 months of experiment

2.2 各組大鼠遠(yuǎn)端小腸GLP-1和PYY的表達(dá)情況

各組大鼠遠(yuǎn)端小腸GLP-1和PYY的表達(dá)情況如圖1～圖3所示，空白組與對(duì)照組相比，具有顯著性差異；使用補(bǔ)腎清肝疏脾法對(duì)大鼠進(jìn)行治療后，GLP-1含量較治療前有顯著性差異。ELISA結(jié)果顯示，空白組與對(duì)照組相比，PYY含量未見顯著性變化，而實(shí)驗(yàn)組大鼠其含量則顯著性增加。

圖1 各組大鼠遠(yuǎn)端小腸GLP-1的表達(dá)Fig.1 The expression of GLP-1 in the distalsmall intestine of rats in each group

圖2 各組大鼠遠(yuǎn)端小腸GLP-1表達(dá)量的比較注：*P<0.05Fig.2 Comparison of GLP-1 expression in the distalsmall intestine of rats in each groupNote:*P<0.05

圖3 各組大鼠遠(yuǎn)端小腸PYY的表達(dá)注：*P<0.05Fig.3 The expression of PYY in the distal smallintestine of rats in each groupNote:*P<0.05

2.3 各組大鼠宏觀生理生化指標(biāo)的變化

各組大鼠血糖、血脂、HOMA-β、體質(zhì)量在實(shí)驗(yàn)0、3、6個(gè)月時(shí)的變化情況見表2和圖4～圖7。從表2可以看出，建立糖尿病模型后，對(duì)照組大鼠血糖、血脂、HOMA-β、體質(zhì)量與空白組相比，0、3、6個(gè)月的時(shí)間點(diǎn)，均有顯著性差異。經(jīng)過中藥湯劑灌胃的大鼠與對(duì)照組相比，各指標(biāo)均有不同程度的改善。

表2 各組大鼠宏觀生理生化指標(biāo)的變化Table 2 Changes of macroscopic physiological and biochemical indexes of rats in each group

圖4 各組大鼠血糖的變化注：與空白組相比，*P<0.05；與實(shí)驗(yàn)組相比，#P<0.05Fig.4 Blood glucose changes of rats in each groupNote: Compared with the blank group,*P<0.05;Compared with the experimental group,#P<0.05

圖5 各組大鼠血脂的變化注：與空白組相比，*P<0.05；與實(shí)驗(yàn)組相比，#P<0.05Fig.5 Blood lipid changes of rats in each groupNote: Compared with the blank group,*P<0.05;Compared with the experimental group,#P<0.05

圖6 各組大鼠HOMA-β的表達(dá)注：與空白組相比，*P<0.05；與實(shí)驗(yàn)組相比，#P<0.05Fig.6 HOMA-β expression of rats in each groupNote: Compared with the blank group,*P<0.05;Compared with the experimental group,#P<0.05

圖7 各組大鼠體質(zhì)量的變化注：與空白組相比，*P<0.05；與實(shí)驗(yàn)組相比，#P<0.05Fig.7 Body weight changes of rats in each groupNote: Compared with the blank group,*P<0.05;Compared with the experimental group,#P<0.05

3 討論

中醫(yī)典籍中將2型糖尿病歸屬于“消渴”范疇?，F(xiàn)代中醫(yī)多認(rèn)為2型糖尿病病因病機(jī)為脾胃運(yùn)化失常、肝失疏泄、痰瘀內(nèi)阻、濕熱內(nèi)蘊(yùn)。脾主運(yùn)化，若飲食不節(jié)，則使中焦之氣壅滯，阻礙脾胃運(yùn)化，導(dǎo)致運(yùn)化失職脾不散精，物不歸化則為痰、濕、濁。中藥及天然植物中的很多成分口服利用率低下，其需要經(jīng)過腸道菌群的轉(zhuǎn)化才能被宿主有效利用，且其對(duì)腸道菌群結(jié)構(gòu)有影響作用，因此腸道菌群可能是中藥發(fā)揮療效的靶點(diǎn)和關(guān)鍵點(diǎn)[11]。

以往研究表明，腸道菌群與2型糖尿病息息相關(guān)，可通過短鏈脂肪酸(乙酸鹽、丙酸鹽、丁酸鹽)激活 Gpr41導(dǎo)致PYY增加。 PYY是一種36-氨基酸肽，主要由位于回腸和大腸腸黏膜的l細(xì)胞分泌。PYY(3-36)抑制腸蠕動(dòng)，并可激活PYY和GLP-1分泌增加，抑制脂肪細(xì)胞胰島素信號(hào)，減少脂肪積聚，可能具有治療人類肥胖的潛力[12]。而G蛋白偶聯(lián)受體(GPCRs)中的 MAPK信號(hào)通路，是2型糖尿病治療的重要發(fā)現(xiàn)靶點(diǎn)之一。許多MAPK蛋白，如GLP-1可能直接參與胰島素抵抗的發(fā)展和β細(xì)胞功能障礙，炎癥的病因可能導(dǎo)致肥胖引發(fā)的2型糖尿病[13-14]。本研究中空白組與對(duì)照組之間的PYY含量并不存在顯著性差異，由此可見，糖尿病大鼠與正常大鼠PYY表達(dá)并無較大差異，PYY的表達(dá)并不因大鼠飲食的變化而變化。但實(shí)驗(yàn)組中發(fā)現(xiàn)PYY含量增加，說明補(bǔ)腎清肝疏脾法治療激活PYY的表達(dá)，可以起到增強(qiáng)的消化功能與糖代謝機(jī)能，促進(jìn)大鼠健康。我們預(yù)測(cè)，如果對(duì)空白組大鼠使用補(bǔ)腎清肝疏脾法進(jìn)行治療，仍能夠增加其PYY的表達(dá)。

前期筆者辨證使用補(bǔ)腎清肝疏脾法治療上百例2型糖尿病患者，隨訪半年以上，均得到不同程度的改善，現(xiàn)通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，證明補(bǔ)腎清肝疏脾法能夠改善糖尿病模型大鼠的血糖、血脂、HOMA-β及體質(zhì)量。此外，本研究對(duì)大鼠腸道菌群及結(jié)腸GLP-1、PYY的研究證明，補(bǔ)腎清肝疏脾法能夠改變腸道菌群結(jié)構(gòu)，并影響結(jié)腸GLP-1和PYY的含量，其影響與前文研究中丙酸-GPR43-GLP-1/PYY通路的機(jī)制相類似。綜上所述，本研究用大鼠糖尿病模型證明了補(bǔ)腎清肝疏脾法對(duì)糖尿病的控制作用，其作用機(jī)制可能是通過改善腸道菌群、GLP-1及PYY含量進(jìn)行的。