間充質干細胞移植改善腦室周圍白質軟化損傷作用的研究*

巴依爾才次克 王彥梅 朱艷萍

(新疆醫科大學第一附屬醫院新生兒科，烏魯木齊 830054)

醫學的進步使得早產兒的存活率取得了極大的增長，但早產兒仍然存在諸多并發癥。腦室周圍白質軟化(periventricular leukomalacia，PVL)是胎兒早產的并發癥之一，會對中樞神經系統的結構和功能造成不可逆的損傷，嚴重影響患兒的認知等中樞功能，然而此類疾病多預后不佳，且目前尚無有效的治療方法[1]。

腦室周圍白質梗死、軟化的病因，可能與胎兒低血壓、腦血流灌注不足、不穩定等因素有關。早產兒中樞系統中的少突膠質細胞(oligodendrocyte，OLs)及少突膠質前體細胞(oligodendrocyte precursor cells，OPCs)對缺血十分敏感。Chung等[2]研究顯示，PVL病理損傷過程中，OPC的增殖、分化受阻，同時OLs發生凋亡，進而髓鞘再生障礙，同時還伴隨有膠質細胞的炎性激活。因此，有效抑制早產兒中樞系統中OLs的凋亡，促進OPC的增殖和分化，是治療PVL的重要思路之一。

神經干細胞在腦損傷后能迅速增殖分化形成OPCs及星形膠質細胞等，對損傷髓鞘進行吞噬，并形成新的髓鞘，產生修復作用[3]。人臍帶間充質干細胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUC-MSCs)是一種多能干細胞，具有在一定條件下分化成神經干細胞的潛質。基于以上事實，本研究旨在探究hUC-MSCs可否用來恢復少突膠質細胞及其前體細胞的功能，進而修復髓鞘損傷。并進一步研究hUC-MSC產生修復作用同時對自身神經干細胞的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑耗材及設備

7 日齡健康清潔級SD大鼠，體質量(18±2)g，購自新疆醫科大學動物實驗研究中心，實驗動物合格證號：No：11400730598260)。FITC-CD73、FITC-CD90、PE-CD105購自eBioscience；RFP慢病毒(上海吉瑪制藥技術有限公司)；蘇木素-伊紅(珠海貝索生物技術有限公司)；TUNEL檢測液(Roche)；嘌呤霉素、BrdU(Sigma)；Caspase-1抗體、Bcl-2抗體(Santa Cruz)；流式細胞儀(BD calibur)；三氣培養箱(Thermo)；異戊烷、腦立體定位儀(上海玉研科學儀器有限公司)；冰凍切片機(Leica)；正置顯微鏡、熒光顯微鏡(尼康)。

1.2 hUC-MSC細胞獲取

獲取健康SD大鼠新生兒臍帶后，DMEM/F12保存送至實驗室。PBS清洗后剪碎，0.1%膠原酶Ⅰ和0.125%胰酶，37 ℃消化30 min，100目濾網過濾后在混有10% FBS 和1%青霉素、鏈霉素雙抗的DMEM/F12培養基中，種瓶培養。傳代2次后，取部分細胞，用流式細胞術進行鑒定。在PBS重懸的細胞中，分別加入CD73、CD90和CD105抗體，4 ℃避光孵育20 min后PBS洗凈，并上機流式細胞儀進行檢測。

將細胞在1×106個/mL的濃度下用MOI=100的RFP慢病毒進行轉染，并用嘌呤霉素篩選制得穩轉hUC-MSC細胞。

1.3 動物分組及模型構建

1.3.1動物分組:采用隨機數表法分為空白組、模型組和移植組，每組24只。選取7日齡SD大鼠構建腦白質損傷模型。

1.3.2模型構建:模型組和移植組大鼠經異戊烷麻醉后于體視顯微鏡下用6-0#尼龍縫合線結扎右側頸總動脈，并縫合傷口。30 min后，在8% O2和 92% N2的恒溫(37 ℃)相對濕度70%的三氣培養箱中缺氧處理2.5 h。空白組僅剝離右側頸總動脈，不進行后續操作。造模結束后，所有大鼠放回母鼠身邊飼養。

1.4 hUC-MSC細胞移植

缺血缺氧造模24 h后，將密度為1×105個/mL的hUC-MSC穩轉細胞用腦立體定位儀注入移植組實驗動物側腦室中(坐標：AP：-0.5 mm；ML：2 mm；DV：-2 mm)。

1.5 認知功能檢測

模型構建及細胞移植14 d后，采用Morris水迷宮方法檢測實驗動物認知功能改變。前4 d，每天固定時間進行一次定位航行訓練，每次訓練都要分別從四個象限將鼠面朝池壁放入，并記錄120 s內尋找平臺的潛伏期，120 s內未能上臺則人工引導上臺(潛伏期記為120 s)。第5天，進行空間探索實驗，將大鼠從任意一個象限面朝池壁放入水中，記錄60 s內穿過平臺所在象限的次數。開展實驗時采用Any-Maze處理系統(Steolting)進行數據獲取。

1.6 腦組織病理學檢測

實驗動物在造模及細胞移植7 d和14 d 后分別進行灌流取腦處理，并制備石蠟切片。1%戊巴比妥鈉麻醉后用冷的PBS心臟灌流，洗凈循環系統中的血液。之后分別用冷的4%多聚甲醛進行心臟灌流、取腦并分別保存于4%多聚甲醛中，4 ℃保存。多聚甲醛保存的樣品由南京東極生物科技公司制作石蠟切片。石蠟切片經二甲苯和不同濃度乙醇脫蠟水化后，分別用蘇木素-伊紅染色，正置顯微鏡下觀察腦室周邊及皮層部位的病理變化。HE染色參照Uehara等的評分方法進行評分[4]。評分標準如下：0度為正常；1度為白質輕度疏松，神經元輕度形變；2度為白質稀疏加深伴空泡化，神經元存在凝固性壞死，并呈三角樣皺縮。

1.7 透射電鏡檢測

新生SD大鼠麻醉后分別用冷PBS和2%戊二醛心臟灌流。取腦后，于冰上在右側胼胝體處切取1 mm3的組織塊，繼續用2%戊二醛和1%四氧化鋨固定，并用不同濃度梯度的乙醇脫水。之后將樣品由電鏡室進行環氧樹脂包埋及制50 nm厚度樣，并進行拍照。圖像分析時，將8 000×放大的樣品照片隨機選取4方視野，采用ITEM圖像分析軟件檢測神經纖維橫斷面的髓鞘數目及厚度。髓鞘厚度=(最薄內徑+最厚內徑)/2。

1.8 細胞凋亡檢測

將各組別實驗動物造模7 d和14 d的腦組織在多聚甲醛中固定后，轉移至不同濃度梯度的蔗糖多聚甲醛溶液中進一步脫水。液氮冷凍后，用冰凍切片機制備10 μm厚冰凍切片。Triton-X100透化并用H2O2滅活后，載玻片上每個組織切片上滴加50 μm TUNEL檢測液避光孵育2 h后DAPI處理5 min標記細胞核。封片后在熒光顯微鏡下觀察。

凋亡相關蛋白的檢測采用造模7 d的腦皮層組織，采用RIPA組織裂解混合液裂解組織，獲取蛋白之后采用BCA試劑盒進行蛋白定量。并將蛋白和上樣緩沖液混合加熱使蛋白變性。聚丙烯酰胺凝膠電泳蛋白質上樣時控制上樣量在20 μg/孔，蛋白分離后濕法轉印至PVDF膜上，BSA封閉后分別加入一抗、二抗工作液孵育，洗掉未結合抗體后滴加ECL發光液，于化學發光檢測儀中拍照，quantity one軟件分析條帶灰度值，并與內參蛋白比較排除誤差，進行量化統計分析。

1.9 細胞增殖檢測

分別于取材前10 h，即造模和移植后2 h對所有實驗動物進行BrdU腹腔注射，每只鼠注射一次，注射劑量為100 mg/kg。

將各組實驗動物造模7 d和14 d的石蠟切片進行BrdU-hUC-MSC雙重標記免疫熒光處理。封片后熒光顯微鏡下觀察。

1.10 統計分析

2 實驗結果

2.1 間充質干細胞分離情況

結果如圖1所示。流式細胞實驗檢測顯示提取出的原代間充質干細胞中，CD73、CD90、CD105等抗體標記后，相較橘色的陰性對照均為陽性表達；且細胞形態學表現為成纖維細胞形態，證明MSC細胞分離純化成功。

圖1 hUC-MSC細胞鑒定Fig.1 hUC-MSC cell identification

2.2 認知功能檢測結果

結果如圖2所示。通過Morris水迷宮實驗發現，相較空白組，進行缺血缺氧造模的大鼠在定位航行實驗中，更偏好沿池壁行進，找到平臺所用時間均顯著增加，而進行hUC-MSC移植的大鼠找到平臺所用時間則降低。在第5天的空間探索實驗中，模型組大鼠探索目標象限的時間和進入目標象限的次數相比空白組均顯著降低。而hUC-MSC的移植則能增加目標象限的停留時間和穿越次數。由此可見，大鼠的空間認知功能得到改善。

圖2 Morris水迷宮實驗結果注：與空白組相比,#P<0.05Fig.2 Results of Morris water maze experimentNote: Compared with the control group, #P<0.05

2.3 細胞增殖檢測結果

結果如圖3所示。通過BrdU摻入實驗及免疫熒光檢測發現，空白組BrdU存在一定程度表達，說明海馬區存在正常的細胞增殖。PVL造模后BrdU表達水平顯著下降，說明腦白質損傷后海馬區細胞的增殖受到抑制，而hUC-MSC的移植則能夠顯著增加海馬區增殖細胞數目，且雙標記免疫熒光實驗發現移植組存在未與hUC-MSC共定位的增值細胞。由此可見，hUC-MSC的移植能夠促進自身神經干細胞的增殖。

圖3 BrdU檢測細胞增殖注：與空白組相比，##P<0.01；與模型組相比，*P<0.05,**P<0.01Fig.3 Cell proliferation detected by BrdUNote: Compared with the model group,*P<0.05,**P<0.01

2.4 病理實驗及透射電鏡檢測結果

結果如圖4和圖5所示。通過對腦室周圍皮層的HE染色檢測發現，空白組神經細胞形態飽滿，細胞核與細胞質界限分明。而模型組神經元變形成三角形或菱形狀，尼氏體固縮，同時膠質細胞存在一定程度的增生。hUC-MSC移植則能減輕這些病理損傷，視野中形態正常的神經元占比增加。

圖4 HE染色檢測病理損傷Fig.4 Pathological lesions were detected by HE staining

圖5 透射電鏡檢測髓鞘超微結構病理改變注：與空白組相比,###P<0.001；與模型組相比，*P<0.05，***P<0.001Fig.5 Ultrastructural changes of myelin sheath were detected by transmission electron microscopyNote: Compared with the control group,###P<0.001; Compared with the model group,*P<0.05, ***P<0.001

透射電子顯微鏡檢測發現相較空白組具有結構完整的髓鞘包覆的神經元，模型組神經纖維排列無序，髓鞘松散、空泡化甚至脫落。量化分析顯示髓鞘厚度及髓鞘數目均顯著降低。而hUC-MSC移植后可見有新的髓鞘形成。隨著時間的推移，髓鞘厚度及數目均有增加，且髓鞘厚度增加顯著。

2.5 細胞凋亡檢測結果

結果如圖6所示。Tunnel凋亡檢測顯示，PVL造模7 d和14 d時，模型組海馬齒狀回部位凋亡細胞數目相較空白組顯著增加。而hUC-MSC移植后，凋亡細胞較模型組顯著減少。而蛋白質免疫印跡檢測也發現皮層部位的Caspase-3、Bcl-2等凋亡相關蛋白也會由于缺氧造模而顯著升高，hUC-MSC的移植則能夠顯著降低這些蛋白的表達水平。

3 討論

腦室周圍白質軟化癥(PVL)是新生兒腦損傷的主要形式，也是早產兒腦癱和認知障礙的主要已知原因[5]。大腦缺血缺氧或炎癥往往會對發育中的新生兒的中樞神經系統造成嚴重損傷[6]。在足月兒中，此類損傷主要影響大腦皮層中的神經元，產生卒中樣損傷。而在早產兒中，大腦白質中的未成熟少突膠質細胞和緊接在新皮層下方的神經元特別脆弱，因此損傷會進一步導致PVL[7]。因此，在構建腦室周圍白質損傷的動物模型時，通常是通過結合單側頸動脈閉塞和降低環境氧，或者通過細菌脂多糖(LPS)激活先天免疫系統誘導中樞神經系統缺氧缺血。兩種方法均可引起彌漫性小膠質細胞活化，促炎性細胞因子和活性氧的大量產生以及腦室周圍促髓鞘形成的少突膠質細胞的損耗[8]。

在本研究中，我們采用臍帶間充質干細胞移植來治療缺血缺氧所致的新生SD大鼠腦室周圍白質軟化損傷模型。通過單側頸總動脈結扎和三氣培養箱中低氧氣氛的培養，實驗動物空間認知功能嚴重損傷，腦室周胼胝體部位髓鞘脫失顯著，鄰近腦室的軀體感覺皮層部位神經元損傷顯著，同時海馬齒狀回部位細胞發生凋亡。上述病理皆與PVL患兒的臨床表現一致。

成體多能干細胞間充質干細胞具有在特定條件下分化形成神經元、少突膠質細胞等中樞系統中多種細胞的潛能，為中樞系統疾病的靶向治療提供了啟示[9]。而人臍帶間充質干細胞(hUC-MSC)由于具有易于獲取，免疫原性低和免疫抑制等優點，因此在干細胞研究領域越來越受到重視[10]。動物實驗及臨床研究均發現臍帶間充質干細胞能減輕和改善腦部病變，提高患者的運動和認知功能。而在hUC-MSC對腦癱兒童的治療中，相較對照組不良事件的發生率無顯著性差異[11]。通過對hUC-MSC治療青光眼的研究發現其能減輕星形膠質細胞的A1極化，降低炎癥因子水平[12]，進而減輕LPS對視網膜神經節細胞的炎癥損傷[13]。

基于以上事實，我們針對hUC-MSC對腦室周圍白質軟化損傷的改善作用進行研究。hUC-MSC移植后，皮層神經元損傷顯著減輕，胼胝體部位髓鞘數量及厚度均增加，海馬部位的凋亡細胞數目均有所減少，同時除hUC-MSC以外，進行增殖細胞數量也顯著增多。水迷宮行為學實驗也顯示hUC-MSC移植后，大鼠的空間學習記憶功能顯著改善。上述結果均說明hUC-MSC的在腦內的增殖能夠促進內源性神經干細胞的增殖和分化，進而對PVL模型所致的腦損傷具有一定治療作用。

綜上所述，我們的研究確定了hUC-MSC對PVL所致腦損傷的干預作用，為hUC-MSC在腦脫髓鞘損傷及相關領域的應用提供了理論依據。